Akadēmiskais centrs
Projekta nosaukums: Jaunu selektīvu cietfāzes ekstrakcijas sorbentu izstrāde vienlaicīgai katehilamīnu un to skābju tipa metabolītu izdalīšanai no bioloģiskas izcelsmes paraugiem
Projekta līguma numurs: 1.1.1.2/VIAA/1/16/224
Projekta īstenošanas termiņš: 01.11.2017 – 31.10.2020 (36 mēneši)
Projekta realizācijai nepieciešamā summa ir 133806 EUR, 5 % (6690,30 EUR) no kuras tiks ieguldīti no LU resursiem.
Projekta mērķis ir jaunā cietfāzes ekstrakcijas sorbenta iegūšana vienlaicīgai selektīvai katehilamīnu grupas neiromediatoru (dopamīns, epinefrīns, norepinefrīns, normetanefrīns) un to gala stadijas metabolītu (homovanililskābes un vanililmandeļskābes) izolēšanai no asins, urīna un citiem bioloģiskiem šķidrumiem.
Darba mērķa sasniegšanai projekts ir sadalīts piecās aktivitātēs, kuru gaitā tiks veikta sorbenta sintēzes metodes izstrāde, ekstrakcijas efektivitātes pētījumi, sorbenta integrācija plūsmas injekciju – elektroizsmidzināšanas jonizācijas – tandēmmasspektrometrijas metodē, kā arī validācijas procedūras īstenošana.
Projekta rezultāti: 2 zinātniskās publikācijas, 2 starptautisko konferenču tēžu sagatavošana, 1 populārzinātniskais raksts.
Pirmajā ceturksnī (01.11.2017 – 31.01.2018) atbilstoši projekta 1. aktivitātei izveidota šablona tipa molekulas (2-feniletiķskābes atvasinājums) kompleksu sērija ar sešiem funkcionālo monomēru kandidātiem (dažādi aizvietotie sulfonamīdu atvasinājumi), lai varētu modelēt mijiedarbību stiprumu plānotā sorbenta aktīvajos centros. Katram kompleksam veikta konformāciju analīze, lietojot Avogadro programmu, un stabīlākās konformācijas izmantotas, lai aprēķinātu kompleksu optimālākās ģeometrijas gāzes fāzē, pakāpeniski palielinot aprēķinu teorijas līmeni (pusempīriskā PM3 metode, Hartrī – Foka metode, blīvuma funkcionāla teorija un M06-2X).
Paralēli ar aprēķiniem izstrādāta un, lietojot izvēlēto reprezentatīvo savienojumu, aprobēta funkcionālo monomēru sintēzes metode. Atbilstoši izstrādātai stratēģijai, funkcionālo monomēru sintēzei nepieciešamas divas stadijas, sākot no komerciāli pieejamā 3-hloropropān-1-sulfonskābes hlorīda. Izmantojot minēto plānu, realizēta pirmā funkcionālā monomēra sintēzes sākuma stadija. Kā parādīja rezultāti, vēlamā starpsavienojuma tīrības pakāpe nebija pietiekoši augsta, tāpēc tika izstrādāta “flash” hromatogrāfijas metode parauga attīrīšanai.
Darba posmā no 01.02.2018 – līdz 30.04.2018 turpināti šablona molekulas un sešu funkcionālo monomēru kandidātu kompleksu kvantu ķīmiskie aprēķini M06-2X/6-31++g(d,p) teorijas līmenī. Rezultātā noskaidrotas optimālās kompleksu struktūras gāzes fāzē, veikta šajās struktūrās esošo ķīmisko saišu svārstību analīze un izrēķināti visi nepieciešamie kompleksu un to sastāvdaļu termodinamiskie rādītāji. Visiem kompleksiem izrēķinātas mijiedarbību enerģijas vērtības gāzes fāzē, kas ļāva sastādīt kompleksu stabilitātes rindu, kas kopumā labi sakrīt ar teorētiskiem apsvērumiem.
Lai pārbaudītu šķīdinātāja ietekmi uz kompleksu stabilitāti, veikta kompleksu ģeometrijas optimizācija šķīdinātāja (metanola) klātbūtnē, lietojot Gaussian programmā iebūvēto PCM modeli un M06-2X/6-31++g(d,p) teorijas līmeni. Iegūtās struktūras pārbaudītas, izmantojot ķīmisko saišu svārstību analīzi, un izrēķināti visi nepieciešamie termodinamiskie parametri.
Darba gaitā turpināta funkcionālo monomēru sintēze. Rezultātā realizēta divu funkcionālo monomēru kandidātu pilnā sintēze un attīrīšana. Vienam no savienojumiem uzņemti 1H KMR un ESI-MS spektri, kas pilnībā pierāda atbilstību vēlamajam savienojumam. Uzsintezētas un attīrītas izejvielas, kuras vajadzīgas vēl divu funkcionālo monomēru sintēzei.
Laika periodā no 02.05.2018 līdz 31.07.2018 veikti iepriekš minēto kompleksu stabilitātes kvantu aprēķini dažādu šķīdinātāju vidē (acetonitrīls, hloroforms un dimetilsulfoksīds) PCM solvatācijas modeļa ietvaros. Dotajos aprēķinos iegūtie termodinamiskie parametri tika salīdzināti ar iepriekšējā periodā aprēķinātajiem lielumiem, kas ļāva izvēlēties trīs funkcionālos monomērus, kuri veido stabilākus kompleksus ar šablona molekulu visos pētāmos šķīdinātājos.
Paralēli aprēķiniem realizēta vēl vienā plānotā funkcionālā monomēra sintēze un attīrīšana, izmantojot iepriekšējos darba posmos izstrādātās metodes. Kā parādīja 1H KMR un ESI/MS analīzes, iegūtā savienojuma uzbūve atbilst vajadzīgajam produktam.
Lai eksperimentāli pierādītu, ka pēc aprēķinu rezultātiem izvēlētie funkcionālie monomēri veido kompleksus ar šablona molekulu reālajos šķīdumos, veikti infrasarkanās spektroskopijas (IS) un 1H KMR eksperimenti. Analīžu rezultātā tika secināts, ka dažu tehnisko trūkumu dēļ, IS nav piemērota metode mērķa sasniegšanai. Turpretī, pēc iegūto 1H KMR spektru interpretācijas var secināt, ka abi partneri izvēlētajos šķīdumos mijiedarbojas savā starpā, jo katrā funkcionālā monomēra pievienošana šablona savienojuma šķīdumam izraisa dažu tuvāko reakcijas centram protonu signāla nobīdes. Lai iegūtu kvantitatīvu informāciju par šāda tipa mijiedarbību stiprumu, veikti t.s. titrēšanas sēriju eksperimenti. Iegūto datu interpretācija un kvantitatīva analīze tiek turpināta.
Laika posmā no 01.08.2018 līdz 31.10.2018, pateicoties sekmīgai projekta 1. aktivitātes izpildei, sākta 2. aktivitāte, kas ir saistīta ar cietfāzes sorbenta sintēzes metodes izstrādi. Izvērtējot iepriekšējā aktivitātē aprēķināto un eksperimentāli noteikto kompleksu termodinamisko lielumu vērtības, kā funkcionālie monomēri sorbenta iegūšanai tika izvēlēti trīs benzilamino grupu saturošie savienojumi. Ņemot vērā to, ka sorbenta sintēzes metodes izstrādei turpmāk būs nepieciešams lielāks minēto savienojumu daudzums, nekā tika izmantots iepriekšējos pētījumos, ir vajadzīga to atkārtota iegūšana. Rezultātā tika sintezēts viens no minētajiem funkcionālajiem monomēriem un veikta tā attīrīšana. Lai paaugstinātu šī savienojuma tīrību, tika nolemts aizvietot agrāk izmantoto attīrīšanas procedūru (apgrieztās fāzes vakuuma šķidrumu hromatogrāfija) ar speciāli izstrādāto preparatīvas AEŠH metodi. Šim mērķim izpētīta eluenta sastāva, eluēšanas veida (izokrātiskais un gradienta režīms) un kolonnā ievadītā parauga masas ietekme uz izšķiršanu starp vajadzīgo vielu un citiem reakcijas maisījuma komponentiem.
Paralēli pārskata periodā veikti pirmie sorbenta sintēzes mēģinājumi, kuros galvenais mērķis bija apgūt radikāļu iniciētās polimerizācijas procedūru. Lai ietaupītu vērtīgo funkcionālo monomēru, šajos eksperimentos kā modeļi izvēlēti dažādi savienojumi, kas savā struktūrā satur 4-vinilbenzil grupu (piem. 4-vinilbenzilhlorīds, 4-vinilbenzilamīns), un veiktā to kopolimerizācija ar divinilbenzolu-50. Pēc rezultātu izvērtēšanas šajos eksperimentos izmantotie reakcijas apstākļi tiks izmantoti vajadzīgo sorbentu iegūšanai turpmākajos pētījumos.
Laika periodā no 01.11.2018 līdz 31.01.2019 projekta 2. aktivitātes ietvaros tika turpināti cietfāzes ekstrakcijas sorbenta sintēzes eksperimenti iepriekšējā posmā izvēlētajos apstākļos. Kā funkcionālais monomērs tika izvēlēts viens no trijiem benzilamino grupu saturošajiem sulfonamīdiem. Dotais savienojums tika kopolimerizēts kopā ar dažādiem šķērssaišu veidošanas reaģentiem šablona molekulas (2-(3,4-dimetoksifenil)-etiķskābe) klātbūtnē termiski iniciētās radikāļu polimerizācijas reakcijas gaitā. Kā parādīja infrasarkanās spektroskopijas dati, funkcionālā monomēra polimerizācija vislabāk notika ar divinilbenzolu-50. Savukārt, citu šķērssaišu veidošanas reaģentu izmantošana (metilēnbisakrilamīds un triallilizocianurāts) deva negatīvu rezultātu. Lai iegūtu sorbentu ar vajadzīgajām ķīmiskajām īpašībām, polimērā esošo sulfonamīda grupu nepieciešams pārvērst par sulfonskābes grupu, veicot hidrolīzes reakciju. Šim mērķim iegūtais polimērs dažādos apstākļos tika apstrādāts ar sālsskābi. Pēc AEŠH un infrasarkanās spektroskopijas datiem tika secināts, ka polimērā esošās sulfonamīda grupas ir noturīgas pret hidrolīzi pat ar 12 M sālsskābi paaugstinātajā temperatūrā, kas neļauj pabeigt vajadzīgā sorbenta sintēzi. Tāpēc, tika nolemts aizvietot iepriekš minēto funkcionālo monomēru ar tādu, kas savā struktūrā satur estera vai amīda grupas, kuras varētu hidrolizēt maigākajos apstākļos. Rezultātā tika izstrādāts 4-vinilbenzil grupu saturošā estera un attiecīgā amīda sintēzes plāns un pārbaudītas tajā esošo stadiju realizācija. Neskatoties uz to, ka minēto savienojumu sintēzei izmantotas sulfonamīdu iegūšanai līdzīgas shēmas, tika konstatēts, ka dažādu blakusreakciju dēļ, iespējams iegūt divus estera un vienu amīda grupu saturošos analogus. Rezultātā pārskata periodā tika iegūts viens no plānotājiem esteriem un veikta tā kopolimerizācija ar divinilbenzolu-50. Lai realizētu dotajā polimērā esošo estera grupu hidrolīzi, tika izpētīti dažādi hidrolīzes apstākļi. Rezultātā pēc AEŠH/MS un infrasarkanās spektroskopijas datiem secināts, ka hidrolīzi var realizēt 2 st. laikā. Lai pārbaudītu funkcionālā monomēra ietekmi uz polimēra iznākumu, turpināta pārējo estera un amīda grupu saturošo analogu sintēze.
Darba posmā (01.02.2019-30.04.2019) pabeigta plānotā 4-vinilbenzil grupu saturošā estera sintēze un attīrīšana, kā arī veikti mēģinājumi iegūt tā analogu, kur estera grupas vietā ir amīda grupējums. Eksperimentu gaitā tika secināts, ka amīda sintēze nav iespējama, lietojot klasisko metodi konkurējošas blakusreakcijas dēļ, savukārt, minētais esteris tika iegūts trijās stadijās. Izolēšanai un attīrīšanai tika lietota vakuuma šķidrumu hromatogrāfija uz apgrieztās fāzes (C18) silikagēla. Dotais savienojums tika izmantots kā funkcionālais monomērs polimerizācijā ar divinilbenzolu-50 (DVB-50) šablona molekulas (2-(3,4-dimetoksifenil)-etiķskābe) klātbūtnē, kas deva iespēju iegūt atbilstošo polimēru un veikt polimērā esošo estera grupu hidrolīzi. Izvērtējot iegūtos rezultātus, tika secināts, ka šajā gadījumā hidrolīze lēni, un tikai ap 12% no estera grupām var tikt hidrolizētas izvēlētajos apstākļos. Ņemot vērā to, ka estera grupu hidrolīzes pakāpe ir zema, kā arī vēlamā monomēra iegūšanai jāiegulda lieli laika un materiālie resursi, nolemts vienkāršot monomēru struktūru un izmantot citu attiecīgo polimēru iegūšanas stratēģiju. Jaunās pieejas ietvaros polimerizācijai izmantoti divi monomēri (N-4-vinilbenzil-N,N-dimetilamīns un 3-fenilpropilakrilāts), kurus iespējams iegūt vienā stadijā, neveicot sarežģītas attīrīšanas procedūras. Turklāt, abi monomēri pēc kopolimerizācijas ar šķērssaišu veidošanas reaģentu veido līdzīgus mijiedarbību centrus kā iepriekšējā stratēģijā izmantotie 4-vinilbenzil grupu saturošie sulfonamīdi un esteri. Minētās metodes ietvaros iegūta polimēru sērija ar izvēlētiem šķerssaišu veidošanas reaģentiem (DVB-50, etilēnglikoladimetakrilāts un metilēnbisakrilamīds) dažādos šķīdinātājos, un veikta tajos esošo estera grupu hidrolīze. Pēc iegūtajiem rezultātiem izvirzīta hipotēze, ka polimerizācijas reakcijai izvēlētais šķīdinātājs (porogēns) un tā daudzums ietekmē tālākās estera grupu hidrolīzes reakcijas konversijas pakāpi, kas būtu saistīts ar polimēra poru izmēru, veidu un struktūru.
Pētījuma gaitā (01.05.2019–31.07.2019) turpināta sorbenta sintēzes optimālo apstākļu piemeklēšana. Izvērtējot iegūto polimēru īpašības, tika secināts, ka metilēnbisakrilamīda/N-4-vinilbenzil-N,N-dimetilamīna/3-fenilpropilakrilāta kopolimēram ir augstāks potenciāls izmantošanai par cietfāzes ekstrakcijas sorbentu, jo sintēzes gaitā veidojas organiskajos šķīdinātājos un ūdenī stabilas sīkdispersās daļiņas (< 1 um, pēc SEM metodes), kuras iespējams viegli izolēt un apstrādāt. Turklāt dotajam polimēram raksturīga augstāka nekā pārējiem kopolimēriem estera grupu hidrolīzes pakāpe ( 44% pēc AEŠH/UV).
Lai uzlabotu nekovalento mijiedarbību stiprumu starp funkcionālo monomēru un šablona molekulu kopolimērizācijas gaitā, tika nolemts aizvietot N-4-vinilbenzil-N,N-dimetilamīna ar N-4-vinilbenzil-N,N,N-trimetilamonija hlorīdu. Rezultātā, tika konstatēts, ka šablona savienojuma daudzums polimērā pēc polimerizācijas reakcijas krietni palielinājās, kas savukārt liecina par lielāka aktīvo centru daudzuma veidošanos pēc šablona izskalošanas.
Norādītajā laika posmā veikti pirmie sorbenta testēšanas eksperimenti. Šim mērķim tika izstrādāta AEŠH/MS/MS kontroles metode vienlaicīgai 9 savienojumu (adrenalīns, noradrenalīns, normetanefrīns, metanefrīns, dopamīns, 3-fenilpropān-1-amīns, homovanilīnskābe, vanilīnmandeļskābe un 3,4-dimetoksifeniletiķskābe) noteikšanai. Statiskā adsorbcijas testa gaitā noskaidrots, ka dotais sorbents spēj vienlaicīgi saistīt gan katehilamīnus gan to metabolītus. Turklāt sorbenta afinitāte ir stiprāka pret adrenalīnu, noradrenalīnu, dopamīnu un visām minētām skābēm. Savukārt metanefrīna un normetanefrīna saistīšana ar sorbentu ir vājāka. Līdzīgajos apstākļos paralēli veiktajā statiskās adsorbcijas testā ar nehidrolizētu polimēru (bez amīnu saistīšanas centriem) konstatēts, ka tam nav afinitātes pret katehilamīniem. Tas pierāda, ka katehilamīnu selektīvo mijiedarbību centri sorbentā veidojas pārsvarā pēc estera grupu hidrolīzes, un saistīšanai ar citām polimēra virsmā esošām grupām ir mazāks ieguldījums.
Kārtējā darba posmā (01.08.2019-31.10.2019) veikta polimēru iegūšanas apstākļu ietekmes izpēte uz katehilamīnu un to metabolītu adsorbcijas īpašībām. Šim nolūkam pētījuma gaitā iegūti desmit polimēri, kuru sintēze realizēta, izmantojot mainīgu funkcionālo monomēru (N-4-vinilbenzil-N,N,N-trimetilamonija hlorīds un 3-fenilpropilakrilāts) un šķērssaišu veidošanas reaģenta (metilēn-bis-akrilamīds) molāro attiecību. Turklāt, puse no minētiem polimēriem iegūta, pievienojot šablona molekulu sintēzes gaitā, lai pēc skalošanas un estera grupu hidrolīzes nodrošinātu selektīvo dobumu izveidi. Savukārt, atlikušo polimēru grupa (kontroles polimēri) sintezēta, nepievienojot šablona molekulu, kas deva iespēju izpētīt selektīvo dobumu ieguldījumu adsorbcijas eksperimentos.
Minēto polimēru spēja saistīt katehilamīnus un to metabolītus pārbaudīta statisko adsorbcijas eksperimentu gaitā, savstarpēji salīdzinot polimēru veiktspēju dažādos šķīdinātājos (ūdens, acetonitrīls, ūdens/acetonitrīla 1:1 maisījums u.c.). Papildus tika pārbaudīta polimēru formas (skābā vai bāziskā) ietekme uz adsorbcijas spēju. Visos minētajos eksperimentos katehilamīnu un to metabolītu koncentrācijas izmaiņas tika novērotas ar darba gaitā izstrādātu plūsmas injekciju – tandēmmasspektrometrijas metodi, kas ir daudz ātrāka, nekā iepriekšējā periodā lietotā AEŠH/MS/MS metode. Minētajos eksperimentos parādīts, ka vislielāko katehilamīnu un to metabolītu koncentrācijas samazināšanos testēšanas šķīdumā var sasniegt, apstrādājot to ar polimēru, kurā sintēzei lietota funkcionālo monomēru/šķerssaišu reaģenta attiecība 1:3 bāzes formā. Turklāt, koncentrāciju samazināšanas starpība starp minēto polimēru un kontroles polimēru (selektivitātes faktors) katehilamīnu gadījumā ir lielāka, nekā atbilstošiem metabolītiem visos šķīdinātājos.
Laika periodā (01.11.2019-31.01.2020) turpināti iepriekšējā darba posmā iegūto polimēru adsorbcijas īpašību raksturošanas pētījumi. Darba procesā tika nolemts eksperimentāli noteikt minēto polimēru adsorbcijas kapacitātes vērtības attiecībā uz adrenalīnu (izvēlēts kā katehilamīnu pārstāvis) un 3,4-dimetoksifeniletiķskābi (šablona molekula, reprezentē katehilamīnu metabolītus). Turklāt, bija nepieciešams uzzināt, kāds no zināmiem adsorbcijas modeļiem (Lengmīra, Freindliha u.c.) labāk raksturo minēto savienojumu mijiedarbības ar polimēriem statisko adsorbcijas testu gaitā. Minēto uzdevumu izpildīšanai tika nolemts konstruēt abu savienojumu adsorbcijas izotermas un pielāgot iegūtajiem eksperimentālajiem punktiem dažādu adsorbcijas modeļu vienādojumus. Pirmajos eksperimentos iegūtie dati liecināja, ka abu savienojumu gadījumā izotermu konstruēšanai nepieciešams ieviest dažāda veida izmaiņas eksperimentālajos apstākļos. Tāpēc, ņemot vērā vairāku mēģinājumu rezultātus, tika izmainīta polimēra masas koncentrācija testēšanas šķīdumos, suspensijas sagatavošanas procedūra un analīzes šķīduma maisīšanas laiks. Rezultātā, lietojot vienu no kontroles polimēriem (iegūts bez šablona molekulas pievienošanas sintēzes gaitā) kā sorbentu, tika iegūta 3,4-dimetoksifeniletiķskābes adsorbcijas izoterma, kas pēc pieņemtās klasifikācijas atbilst S-veida izotermām. Turpmākajā darbā tiks turpināta abu savienojumu izotermu konstruēšana, izmantojot atlikušos polimērus kā sorbentus.
Darba posmā (01.02.2020-30.04.2020) pabeigta 3,4-dimetoksifeniletiķskābes un adrenalīna adsorbcijas datu iegūšana un attiecīgo izotermu konstruēšana, lietojot 8 iepriekšējos darba periodos sintezētos polimērus kā sorbentus. Iegūto līkņu aproksimācijai tika izmantoti vairāki modeļi (Lengmīra, Freindliha u.c.) kopā ar nelineārās regresijas metodi. Rezultātā tika noteikti svarīgāki parametri (monoslāņa kapacitāte un mijiedarbību konstante), kuri apraksta minēto vielu mijiedarbības ar katru no polimēriem. Izotermu analīze palīdzēja secināt, ka šablona savienojuma pievienošana polimerizācijas maisījumam izmaina pētāmo vielu adsorbcijas procesa modeli uz iegūtā polimēra (t.s. MIP) un palielina šī sorbenta kapacitāti salīdzinājumā ar kontroles polimēriem (t.s. NIP), liecinot par dažāda veida mijiedarbību mehānismiem. Turklāt, MIP un NIP tipa polimēru izotermu formas salīdzināšana abu savienojumu gadījumā palīdzēja noskaidrot, ka MIP monoslānis pārsvarā tiek piesātināts ar monomēriem, savukārt, lielākai NIP polimēru daļai novērota augstākas kārtas molekulāro klasteru adsorbcija.
Lai noteiktu MIP un NIP tipa polimēru selektivitāti (spēja atšķirt līdzīgas struktūras savienojumus), divi MIP un tiem atbilstošie NIP polimēri tika uzpildīti AEŠH mikrokolonnās, kas ļāva izpētīt 16 dažādu savienojumu (katehilamīni, to metabolīti un līdzīgi savienojumi) hromatogrāfiskās aiztures īpašības uz dotajiem sorbentiem. Eksperimentu rezultātā tika noteikta vāja un stipra kustīgā fāze, kuras tiks izmantotas turpmākajā cietfāzes ekstrakcijas metodes izstrādē. Turklāt, balstoties uz rezultātiem, tika izvirzīta hipotēze par galvenajiem pētāmo vielu sorbcijas mehānismiem. Neskatoties uz to, ka pētījums nav pabeigts (nav izpētītas vēl divu atlikušo MIP un atbilstošo NIP sorbcijas īpašības), iegūtie rezultāti norāda uz atšķirībām starp MIP un NIP selektivitāti atkarībā no funkcionālā monomēra/šķērssaišu veidošanas reaģenta attiecības polimēra iegūšanas stadijā.
Daļa no iegūtajiem rezultātiem tika prezentēta mutiskajā ziņojumā “Liquid chromatographic retention behaviour of catecholamines and their acidic metabolites on newly synthesized molecularly-imprinted polymeric sorbents” 10. starptautiskā hromatogrāfijas kongresa “10th World Congress on Chromatography” laikā, kas tika realizēts interaktīvā semināra formā 17.04.2020.
Laika posmā (01.05.2020-31.07.2020) pabeigta atlikušo divu MIP un kontroles (NIP) polimēru pildīšana AEŠH mikrokolonnās. Veicot selektivitātes testēšanu, tika novērots, ka daži polimēri izraisa pārāk augstu spiedienu AEŠH apstākļos, kas neļāva pabeigt minētos eksperimentus un salīdzināt visu sintezēto polimēru veiktspēju. Tāpēc tika nolemts izpētīt selektivitāti statisko testu gaitā, apstrādājot noteikto polimēra iesvaru ar katehilamīnu, to metabolītu un līdzīgo savienojumu maisījumu. Eksperimentu gaitā bija aprēķināti dažādi parametri, ieskaitot imprintēšanas faktoru, sadalīšanas koeficientu, selektivitātes faktoru u.c. Izvērtējot rezultātus, tika secināts, ka MIP polimēri spēj adsorbēt katehilamīnus ar krietni augstāku selektivitāti salīdzinājumā ar kontroles NIP polimēriem, kas pierāda izvēlētās polimēru iegūšanas metodes pareizību. Turpretī, MIP polimēru selektivitāte attiecībā uz katehilamīnu metabolītiem bija salīdzināma ar kontroles polimēriem, kas liecināja par lielu neselektīvo mijiedarbību ieguldījumu adsorbcijas procesā. Lai uzlabotu situāciju, tika izmainīta reaģentu attiecība polimēra iegūšanas reakcijas gaitā, un sintezēts jauns polimērs. Pētījuma gaitā tika izpētīta dotā polimēra spēja adsorbēt 3,4-dimetoksifeniletiķskābi un adrenalīnu, konstruētas atbilstošas adsorbcijas izotermas, un līdzīgi, kā iepriekš sintezētajiem polimēriem, veikti statiskās adsorbcijas testi, lai noteiktu selektivitāti attiecībā uz katehilamīniem un to metabolītiem. Testu rezultāti parādīja, ka minētā polimēra spēja selektīvi adsorbēt katehilamīnu metabolītus krietni uzlabojas salīdzinājumā ar iepriekš sintezētajiem polimēriem. Eksperimentu gaitā tika parādīts, ka selektivitāti iespējams uzlabot, palielinot polimēra iesvara masu. Rezultātā relatīvā selektivitātes faktora vērtības homovanilīnskābes un vanililmandeļskābes gadījumā bija attiecīgi 11 un 13 reizes lielākas salīdzinājumā ar kontroles polimēru. Šajā un iepriekšējos periodos veikto eksperimentu dati tika apkopoti iesniegtajā publikācijā.
Pēdējā projekta ceturksnī (01.08.2020-31.10.2020) izvēlēts polimērs ar labāku katehilamīnu un to metabolītu adsorbcijas spēju ar mērķi izstrādāt cietfāzes ekstrakcijas metodi selektīvai minēto savienojumu izolēšanai no asins plazmas paraugiem. Ņemot vērā polimēra daļiņu tieksmi radīt augstu spiedienu un zemu plūsmas ātrumu klasiskajos cietfāzes ekstrakcijas apstākļos, tika nolemts veikt dispersīvo cietfāzes ekstrakciju (DCFE), kad paraugs tiek apstrādāts ar adsorbenta suspensiju statiskajos apstākļos. Mērķa īstenošanai izpētīta svarīgāko DCFE procedūras parametru ietekme uz pētāmo savienojumu adsorbcijas un desorbcijas efektivitāti, ieskaitot polimēra masu, šķīdinātāja sastāvu, tilpumu un apstrādes laiku. Lai kontrolētu DCFE procedūras veiktspēju, paralēli tika izstrādāta augsti efektīvās šķidrumu hromatogrāfijas – tandēmmasspektrometrijas metode katehilamīnu un to metabolītu vienlaicīgai kvantitatīvai noteikšanai.
Izstrādātā DCFE metode tika aprobēta, lietojot asins plazmas paraugus. Kā galvenais kritērijs sorbenta veiktspējas kontrolei izmantota atgūstamība. Pētījuma gaitā konstatēts, ka katehilamīnu gadījumā plazmas klātbūtnē tā ievērojami samazinās un dažiem katehilamīnu pārstāvjiem var sasniegt līdz pat 5%. Šis novērojums saistīts ar parauga sastāvā esošiem proteīniem, kas spēj bloķēt sorbenta virsmu. Problēmas novēršanai izpētītas dažāda veida proteīnu izgulsnēšanas procedūras. Minēto darbību realizācija ļāva sasniegt 30–95 % atgūstamības vērtības katehilamīniem un to metabolītiem. Turpmākajos pētījumos tiks turpināta metodes pilnveide un pētīti apstākļi, kas palīdzētu palielināt atgūstamību dažiem katehilamīnu pārstāvjiem.
Apkopojot dažādos projekta posmos iegūto materiālu, tika sagatavota un iesniegta publikācija. Dati tika prezentēti virtuālajā “Material Science and Applied Chemistry 2020” konferencē postera “Study of Chromatographic Properties of Catecholamines and their Acidic Metabolites Using Novel Molecularly Imprinted Polymers as Stationary Phases” veidā 23.10.2020.