Smadzeņu audu ilgtermiņa funkcionalitātes izmaiņu izpēte pēc išēmiska insulta

Projekta nosaukums: Smadzeņu audu ilgtermiņa funkcionalitātes izmaiņu izpēte pēc išēmiska insulta

Projekta līguma numurs: 1.1.1.2/VIAA/4/20/626

Projekta vadītājs (pēcdoktorants): pētnieks, Dr. med. Vladimirs Piļipenko

Projekta sadarbības partneri: nav

Projekta īstenošanas termiņš: 01.01.2021.-30.06.2023.

Projekta kopējais finansējums, LU daļa: 111,504.90 EUR, LU daļa: 5,575.25 EUR

Projekta mērķis: Izpētīt išēmiskā insulta izraisītas ilglaicīgas izmaiņas (2, 4 un 6 mēnešus pēc insulta) eksperimentālo dzīvnieku uzvedībā un vairākos smadzeņu procesos (neiroiekaisumā, neiro- un angioģenēzē, mitohondriju funkcionalitātē un glutamāta toksicitātē).

Projekta rezultāti: 1 iesniegta publikācija, 2 starptautisku zinātnisku konferenču tēzes, 2 mobilitātes komandējumi, 1 recenzēts bakalaura vai maģistra darbs, 2 vadīti bakalaura vai maģistra darbi.

I ceturksnis (01.01.2021.–31.03.2021.)

Projekta pirmā ceturkšņa sākumā ir veiktas imūnhistoķīmijas un imūnfluorescences analīzes, ar kurām pārbaudīta neirokaisumā (GFAP, Iba-1), angioģenēzes (VEGF) un neironu mielinizācijas (MBP) procesos iesaistīto proteīnu izmaiņas 2 mēnešus pēc eksperimentāli izveidota išēmiska insulta modeļpelēs. Iegūtie dati apkopoti 3 konferenču tēzēs un iesniegti starptautiskajā LU Zinātniskajā konferencē, kas notika 23.-24. aprīlī.

II ceturksnis (01.04.2021. – 30.06.2021.)

Projekta otrajā ceturksnī veikta dubultā imūnfluorescence, nosakot neiroblastu diferenciāciju un neiroģenēzes procesu norisi subakūti pēc išēmiska insulta. Iegūtie rezultāti iesniegti tēžu veidā 13. Pasaules Insulta Kongresā (World Stroke Congress), kas notiks 2021. gada 28.-29. oktobrī. Šobrīd tiek sagatavots raksts par bioķīmiskajām izmaiņām 2 mēnešus pēc izveidota išēmiska insulta. Ir aprobēts atvērta lauka uzvedības tests veseliem un išēmiska insulta modeļdzīvniekiem un iegūti uzvedības dati. Plānots veikt arī citus uzvedības testu aprobāciju, lai noteiktu to piemērotību išēmiska insulta izraisīto motoro traucējumu analīzei.

III ceturksnis (01.07.2021. – 30.09.2021.)

Projekta trešajā ceturksnī modelēja išēmisko insultu modeļdzīvniekiem, lai noteiktu ilgtermiņa izmaiņas vairāku smadzeņu procesu norisē 6 mēnešus pēc operācijas. Ar iegūtiem audiem plānots veikt imūnhistoķīmisko analīzi, lai noteiktu izmaiņas neiroģenēzes, angioģenēzes, neironu mielinizācijas procesos (kontroles un insulta grupas). Līdz šīm iegūtie dati par izmaiņām dzīvnieku smadzeņu procesos 2 mēnešus pēc išēmiska insulta attālināti prezentēti LU Zināšanu agorā 2021. gada 24. septembrī. Tiek rediģēts raksts par subakūtām (2 mēnešu) izmaiņām dzīvnieku smadzeņu procesos pēc eksperimentālā išēmiska insulta.

IV ceturksnis (01.10.2021.-31.12.2021.)

Rezultāti par izmaiņām neiroģenēzes procesā veselo un išēmiska insulta modeļa dzīvnieku (2 mēnešus pēc insulta izveidošanas) smadzenēs prezentēti postera veidā attālināti Pasaules Insulta Kongresā (World Stroke Congress, WSC2021) konferencē, kas notika 2021.g. 28.-29. oktobrī (postera nosaukums "Investigation of neurogenesis in the early subacute stage following filamentous middle cerebral artery occlusion in mice").

Ir veikta antivielu pret GFAP (gliālo fibrilāro skābo proteīnu) un MBP (mielīna bāzes proteīnu) imūnfluorescentā analīze pie dažādiem nosacījumiem (trīs dažādas antivielu koncentrācijas, divi dažādi paraugu inkubēšanas laiki ar sekundāro antivielu). Optimizēts protokols, pēc kura veiks imūnfluorescenes analīzi 6 mēnešu pētījuma audos februārī.

V ceturksnis (01.01.2022. - 31.03.2022.)

Piektajā ceturksnī norisinājās darbs ar 6 mēnešu pētījuma izmēģinājuma dzīvniekiem. Sākot no 24 nedēļas, visiem izmēģinājuma dzīvniekiem veica intraperitoneālās bromodeoksiuridīna (BrdU, 50 mg/kg) BrdU inkorporējās dalošo šūnu kodolos un tos iezīmē. Pirmai dzīvnieku daļai BrdU injicēja, lai vēlāk noteiktu neiroblastu skaitu (divas BrdU devas vienas dienas laikā), otrai daļai – lai noteiktu to neiroblastu skaitu, kas pārtapa par neironiem (6 BrdU devas trīs dienu laikā). Pirmās daļas dzīvniekus perfuzēja nākamajā dienā pēc BrdU ievadīšanas, bet otrās daļas dzīvniekus – divas nedēļas pēc pēdējās BrdU ievadīšanas (šajā laikā neiroblasti kļūst par neironiem). Nākamajā ceturksnī plānots attīstīt BrdU imūnfluorescences protokolu, lai ar šo metodi noteiktu neiroblastu un nobriedušu neironu proporciju pētāmo dzīvnieku smadzeņu audos (BrdU/DCX un BrdU/NeuN dubultā imūnfluorescence), kā arī noteikt astrocītu augšanas intensitāti, veicot BrdU/GFAP imūnfluorescenci). Iegūtie smadzeņu audi tika sagriezti 20 mikrometru sekcijās un ievietoti etilēnglikola un sukrozes šķīdumā glabāšanai pirms izmantošanas imūnfluorescentai analīzei.

Izieti kursi Almere, Nīderlandē, Rene Remie Surgical Skills Centre (28.02.-04.03.2022.), kuros pilnveidotas prasmes veikt fMCAo metodi pelēm bez externa communis artērijas ligācijas, rezultātā veidojot kontrolējamāko išēmisko insultu (zemāks plašas išēmijas risks). Kursos apgūtas arī stereotakses ķirurģijas prasmes un noklausītas lekcijas par katetrizēšanu, aseptisko ķiruŗgiju un šūvju uzlikšānas tehnikām.

VI. ceturksnis (01.04.2022. - 30.06.2022.)

Sestajā ceturksnī turpinājās darbs ar 6 mēnešu pētījuma izmēģinājuma dzīvnieku uzvedības datiem (Kondzielas tests un gaismas stara tests), kā arī imūnhistoķīmiskām analīzēm. Ir izveidots un optimizēts BrdU imūnfluorescences protokols, lai noteiktu neiroblastu un nobriedušu neironu proporciju pētāmo dzīvnieku smadzeņu audos (BrdU/DCX un BrdU/NeuN dubultā imūnfluorescence), kā arī noteikt astrocītu augšanas intensitāti, veicot BrdU/GFAP imūnfluorescenci). Izmantojot optimizēto protokolu, iegūti dati par BrdU/DCX ko-ekspresiju izmēģinājuma dzīvnieku hipokampa dentate gyrus rajonā un laterālajos ventrikuļos – divās neirogēnajās zonās zīdītāju smadzenēs.

VII. ceturksnis (01.07.2022. - 30.09.2022.)

Septītajā ceturksnī veikts Rotarod uzvedības test 6 mēnešu pētījuma izmēģinājuma dzīvniekiem, kā arī optimizēts BrdU imūnfluorescences protokols, lai noteiktu neiroblastu un nobriedušu neironu proporciju pētāmo dzīvnieku smadzeņu audos (BrdU/DCX dubultā imūnfluorescence). Šobrīd tiek iegūti un analizēti dati par BrdU/DCX ko-ekspresiju izmēģinājuma dzīvnieku hipokampa dentate gyrus rajonā un laterālajos ventrikuļos. Tam sekos Brdu/NeuN ko-ekspresijas noteikšana šajos rajonos tiem dzīvniekiem, kam noteica BrdU inkorporēšānu un nobriešanu divu nedēļu laikā pēc vielas ievadīšanas.

VIII. ceturksnis (01.10.2022. - 31.12.2022.)

Šajā ceturksnī veicu dubulto imūnhistoķīmijas analīzi ar sekudārām fluorescentām antivielām, lai noteiktu, cik no dalošām šūnām izmēģinājuma dzīvnieku smadzenēs ir neiroblasti (BrdU/DCX-pozitīvās šūnas). Šobrīd dati ir izanalizēti un tiks iesniegtas tēzes LU Zinātniskajai konferencei, kas notiks 2023. gada 24.-25. martā. Ir veikti arī uzvedības testi dzīvniekiem, kas ir nodzīvojuši 6 mēnešus pēc eksperimentāla išēmiska insulta izveidošanas. Testi ir: atvērta lauka tests (lokomotorā aktivitāte un bailes), barības satveršanas un Kondzielas tests (funkcionālo traucējumu noteikšana) un Rotarod tests motorās kontroles noteikšanai.

IX. ceturksnis (01.01.2023. - 31.03.2022.)

Projekta devītajā ceturksnī īstenota imūnhistoķīmiskā analīze ar fluorescentām sekundārām antivielām BrdU un GFAP, kā arī BrdU un NeuN ko-lokalizācijai corpus striatum, subventrikulārajā zonā un hipokampa rajonos izmēģinājuma dzīvniekiem. Dati par BrdU/DCX pozitīvo šunu skaita izmaiņām gan starp grupām (veselām, viltus operētām un insulta grupas pelēm), gan starp smadzeņu puslodēm katras grupas ietvaros prezentēti online postera veidā LU Zinātniskajā konferencē, kas notika 2023. gada 24. un 25. martā. Periodā no 09.01.2023. līdz 10.03.2023. īstenoju mobilitāte uz Tartu Universitāti (prof. Tambet Teesalu grupa), kuras ietvaros saņēmu no prof. Augustas Pivoriūnas ekstracelulārās vezīkulas, un tās esmu sajūdzis ar prof. Teesalu laboratorijā atklātiem smadzeņu audus penetrējošiem peptīdiem; tad biju veicis šī vezīkulu un peptīdu kompleksa saistīšānas pārbaudi šūnu kultūrā (prostātas vēža šūnu līnijā). Papildus šim, esmu arī audzējis PPC1 un M21 līniju šūnas, lai no tām izolētu ekstracelulārās vezīkulas, kas kalpotu par pozitīvo kontroli. Pārbaudīju arī šo vezīkulu saistīšanās pārbaudi PPC1 un M21 šūnu kultūrā, izmantojot plūsmas citometrijas metodi.

X. ceturksnis (01.04.2023. - 30.06.2023.)

Projekta pēdējā ceturksnī tika sagatavots raksts par uzvedības izmaiņām 2 mēnešu pēc išēmiska insulta viltus operētām un insulta modeļa pelēm. Izmantoti atklātā lauka testa un kopējās aktivitātes dati (no TSE PhenoMaster aparāta), raksts tapis sadarbībā ar partneriem no Polijas (Nencki Institūts Varšavā). Raksts bija iesniegts žurnālā Behavioural Brain Research un 26.06.2023 saņemta atbilde no žurnāla ar lūgumu veikt nelielas korekcijas rakstā, lai tas tiktu publicēts. Turpinājās arī sadarbība ar Tartu Universitāti, kur došos jūlijā, lai turpinātu darbu ar ekstracelulāro vezīkulu funkcionalizēšanas eksperimentiem, izmantojot zaļo fluorescento proteīnu ekspresējošās šūnu līnijas.

Vladimirs Piļipenko sava pēcdoktorantūras projekta “Smadzeņu audu ilgtermiņa funkcionalitātes izmaiņu izpēte pēc išēmiska insulta” ietvaros sadarbībā ar zinātniekiem no Nencki eksperimentālās Bioloģijas institūta ir veicis pētījumu par ilgtermiņa funkcionālajām izmaiņam pēc išēmiska insulta.

Vladimirs un viņa kolēģi (LU MF Farmakoloģijas katedras grupa), sadarbojoties ar profesora Leszek Kaczmarek grupu ir veikusi ilgtermiņa išēmiska insulta izmaiņu izpēti – 2 un 6 mēnešus pēc mākslīgi radītā išēmiska insulta izmēģinājuma dzīvniekos. Ir atklāts, ka īstermiņa izmaiņas (līdz mēnesim pēc insulta) izmēginājuma dzīvniekos ietver ne tikai svara zudumu, neiroloģiskos deficītus un ierobežotu spēju veidot ligzdu (nest building), bet arī izmaina dzīvnieku ikdienas ieradumus, piemēram, dzeramā ūdens pudeles izvēli. Šos datus ieguva kolēģi no Nencki institūta Varšavā, izmantojot jauno uzvedības uzraudzības sistēmu IntelliCage. Savukārt LU MF veikta pētījumu daļa uzrāda, ka līdz pat 6 mēnešiem pēc išēmiska insulta var novērot palielinātu trauksmi, gaitas nestabilitāti un īsāku noietu distanci. Vēl interesantāk ir tas, ka, salīdzinājumā ar veselām pelēm, išēmiska insulta modeļpeles bija daudz aktīvākas nakts laikā, kas noteikts ar TSE PhenoMaster iekārtas palīdzību. Kopumā, iegūtie dati parāda, ka išēmisks insults rada ne tikai akūtas, bet arī ilgtermiņa izmaiņas uzvedībā, un ka ir svarīgi izvēlēties piemērotāko uzvedības testu, lai šīs izmaiņas noteiktu. Nākotnē šie dati tiks izmantoti, lai pareizāk noteiktu jauno terapiju efektivitāti uz neiroloģiskiem traucējumiem pēc insulta, gan īstermiņa, gan ilgtermiņa. Šobrīd raksts ir iesniegts žurnālā Behavioural Brain Research un ir recenzēšanas stadijā.

Pēcdoktorantūras projekts nr. 1.1.1.2/VIAA/4/20/626 ar nosaukumu “Smadzeņu audu ilgtermiņa funkcionalitātes izmaiņu izpēte pēc išēmiska insulta” veikts, pateicoties ERAF finansējumam.