Jauni no Zymomonas mobilis iegūti antimikrobiālie peptīdi pielietojumam ādas un mīksto audu infekciju terapijā

Projekta nosaukums: Jauni no Zymomonas mobilis iegūti antimikrobiālie peptīdi pielietojumam ādas un mīksto audu infekciju terapijā

Projekta līguma numurs: 1.1.1.1/19/A/097

Projekta partneri: SIA "Alternative Plants"

Projekta īstenošanas termiņš: 36 mēneši (01.10.2020.–30.09.2023.)

Projekta kopējais finansējums: 601160.42 EUR

Projekta zinātniskais vadītājs: Reinis Rutkis

Projekta administratīvais vadītājs: Jānis Briedis

Projekta mērķis: inovatīvu antimikrobiālo peptīdu izstrāde ādas un mīksto audu infekciju ārstēšanai, izmantojot modernas, savstarpēji papildinošas aktivitātes. Šis mērķis tiks sasniegts zinātniskajai institūcijai sadarbojoties ar nozares partneri, iesaistot pirmsdiploma un doktorantūras studentus, kā arī doktora grāda pretendentus un publicējot iegūtos rezultātus augsta līmeņa zinātniskos žurnālos.

Projekta darbību īstenošana uzsākta 01.10.2020.

Projekta “Jauni no Zymomonas mobilis iegūti antimikrobiālie peptīdi pielietojumam ādas un mīksto audu infekciju terapijā” realizācijas laikā tika sekmīgi pierādīta baktēriju Z. mobilis  spēja vidē sekretēt savienojumus ar augstu antimikrobiālo aktivitāti pret projektā pētāmiem mikroorganismiem, kas izraisa ādas un mīksto audu infekcijas slimības (ESKAPE grupas patogēni).  Analizējot Z.mobilis celmus tika konstatēts, ka augstākā antimikrobiālā aktivitāte pret ESKAPE patogēniem piemīt celmam ATCC 10988. Pētot Z. mobilis antimikrobiālās aktivitātes atkarību no kultivēšanas apstāķļiem, tika konstatēts, ka tā  saglabājas tikai Z. mobilis baktērijas kultivējot aerobos apstāķļos, kas netieši norāda uz antimikrobiālā efekta saistību ar mikroorganismu aerobo metabolismu. Z. mobilis kultūrvides ar augstu antimikrobiālo aktivitāti frakcionēšanas rezultātā izdevās noskaidrot, ka antimikrobiālo efektu noteicošais savienoijums ir termostabils līdz 90 grādiem celsija, ir labi ūdenī šķīstošs un mazāks par 3000 Da. Tālākai tā identifikācijai tiks izmantotas masspektometrijas un kodolmaknētiskās rezonanses metodes. 

26.03.2021.

Projektā turpināts darbs ar Z.mobilis celma ATCC 10988 kultūrvides ar augstu antimikrobiālo aktivitāti frakcionēšanas materiāla testēšana pret projektā pētāmiem mikroorganismiem, kas izraisa ādas un mīksto audu infekcijas slimības (ESKAPE grupas patogēni). Uzsākts darbs arī pie antimikrobiālā efekta noteicošā savienojuma identifikācijas ar masspektrometrijas un kodolmagnētiskās rezonanses metodēm. Frakcionētajam materiālam ar augstāko antimikrobiālo aktivitāti pēc iekoncentrēšanas uzsākta citotoksicitātes izvērtēšana pēc OECD TG 129 vadlīnijām peļu embrionālo fibroblastu līnijā Balb/c 3T3, koncentrācijās no 0.078 – 10.0%. Testētajam paraugam tiks noteikts arī IC50, salīdzinot ar šķīdinātāju. Antimikrobiālo savienojumu saturošās frakcijas citotoksicitātes izvērtējums ir būtisks priekšnosacījums tālākai imunomudulāro īpašību izvērtēšanai, kas paredzēta projekta turpinājumā.

22.06.2021.

Turpināta antimikrobiālās aktivitātes analīze šķidrajās kultūrās pētot celmu ar augstāko antimikrobiālo aktivitāti pret ESKAPE patogēniem - Z. mobilis ATCC 10988. Pētot Z. mobilis antimikrobiālās aktivitātes atkarību no kultivēšanas apstāķļiem, tika konstatēts, ka anaerobi audzētām kultūrām  nonākot aerobos apstāķļos antimikrobiālā aktivitāte ir augstāka, kā pilnībā kultivējot šūnas aerobi, kas netieši norāda uz ar antimikrobiālu efektu saistīto enzīmu ekspresijas līmeņa atšķirību. 

Uzsākts drošuma un efektivitātes novērtējums antimikrobiālos aģentus saturošiem Z. Mobilis supernatantiem. Testējot frakcionēts 20x koncentrēts paraugs citotoksicitāti, pēc OECD TG 129 vadlīnijām peļu embrionālo fibroblastu līnijā Balb/c 3T3, testētajam paraugam IC50 aprēķināts 4.57%. Testētais koncentrāciju diapazons: 0.078-10.0%. Atšķirība no šķīdinātāja (bufera) ir statistiski nozīmīga: p=0.0266 (t tests). 

Uzsākts darbs pie mērogošanas pamatparametru telpas izveides lai palielinātu propionāta un acetāta sintēzi aerobos apstākļos vienlaikus saglabājot augstu levāna sintēzi. 

21.09.2021.

Projektā “Jauni no Zymomonas mobilis iegūti antimikrobiālie peptīdi pielietojumam ādas un mīksto audu infekciju terapijā” pabeigts darbs  piw Z.mobilis celma ATCC 10988 aktīvo antimikrobiālo savienojumu identificēšanas. Eksperimentāli ir ticis apstiprināts, ka Z. mobilis antimikrobiālo aktivitāti pamatā nodrošina sintezēto organisko skābju, galvenokārt propionāta un acetāta, klātbūtne supernatanta frakcijā mM koncentrācijā. Papildus analizējot supernatanta aktīvāko hromatogrāfiski iegūto frakciju īpašības netika gūts apstiprinājums iespējamai peptīdu klātbūtnei antimikrobiālās aktivitātes nodrošināšanā. Minētie rezultāti ir apkopoti ziņojumā, kas iesniegts publicēšanai žurnālā “Fermentation” Impakta faktors: 3.975 (2020).

Ir tikusi parādīta Z. mobilis supernatanta frakcijā esošo polisaharīdu Levānu stimulējošā ietekme uz perifēro asiņu mononukleāro šūnu citokīnu IL-6, IL-8 un TNF-α sekrēciju. Ādas keratinocītu un dermas fibroblastu kultūrās parādīta levāna zemā citotoksicitāte. Līdzšinējie rezultāti iezīmē supernatanta potenciālu pielietojumu ādas un gļotādas brūču un iekaisumu terapijā un  profilaksē.

Projekta turpinājumā ir paredzēta heterologa antimikrobiālu peptīdu ekspresija Z. mobilis, kas sinerģiski mijiedarbojoties ar sintezētā levāna imūnmodulējošām un organisko skābju antimikrobiālajām īpašībām, supernatanta liofilizēto materiālu ļautu pielietot ādas un mīksto audu infekciju terapijā. Imunomodulējošās iedarbības raksturošanai uzsākti papildus eksperimenti in vitro šūnu kultūrās inducējot iekaisumu.

22.12.2021.

Pašreizējā projekta posmā ir uzsākta dažādu jaunu, ķīmiski sintezētu AMP izstrāde un raksturošana ar mērķi perspektīvākos kandidātus ekspresēt Z. mobilis un E. coli šūnās. Septiņi no 14 sintezētajiem peptīdiem tika izvēlēti, pamatojoties uz literatūrā pieejamiem datiem par to aktivitāti pret ESKAPE grupas patogēniem, savukārt, 7 bija jauni, projekta grupas dalībnieku racionāli izstrādāti peptīdi. Līdz šim no 7 pārbaudītajiem peptīdiem visdaudzsološākais peptīds RP556 [W. Woodburn et al (2020) Antibiotics 2020, 9, 23] uzrādīja zemu citotoksiskumu zīdītāju šūnām, vienlaikus nodrošinot augstu antibakteriālo aktivitāti pret visiem ESKAPE patogēniem, bet ne pret Z. mobilis. Paralēli jaunu peptīdu antimikrobiālo īpāšību izvērtēšanai perifērās asins mononukleārās šūnās tika novērtētas Z. mobilis producētā levāna pretiekaisuma īpašības, parādot Z. mobilis levāna pozitīvo lomu  pretiekaisuma citokīnu sekrēcijā. Turklāt RP556 peptīdi, kas papildināti ar GFOR periplasmatisko signālsekvenci un TEV proteāzes linkeri, ir sekmīgi ekspresēti Z. mobilis šūnās. Līdzšinējie rezultāti netieši parāda RP556 peptīda klātbūtni ne tikai  Z. mobilis šūnu lizātos, bet arī kultūras barotnē, kas ir īpaši noderīgi pēcapstrādes procesā, kombinējot peptīdu antimikrobiālās un levāna imunomodulējošās īpašības pielietojama gala produkta veidošanā.

Pirmajā projekta izpildes pusē esam ieguvuši pierādījumus, kas norāda uz augsto Z. mobilis levāna potenciālu modulēt pro- un pretiekaisma citokīnu sekrēciju.

30.03.2022.

Turpināts darbs pie peptīdu ekspresijas sistēmas pilnveides Z. mobilis: (i) izveidoti jauni peptīdu un konjugēto proteīnu konstrukti, (ii) izveidota uz zaļā fluoriscējošā proteīna (GFP) bāzēta ekspresijas vektoru sistēma promotera efektivitātes vienkāršotai novērtēšanai un optimizācijai.

Labāko peptīdu kandidātu atlasei ir izveidota Langmuir-Blodgett eksprerimentālā iekārta, kas paredzēta peptīdu un baktēriju membrānu mijiedarbības pētījumiem. Iekārtas pielietošana nodrošinās kvantitatīvu mijiedrbības datu ieguvi to tālākai komplimentācijai ar jau noteiktajām peptīdu  antimikrobiālajām aktivitātēm pret dažādu sugu baktērijām.

Sagatavots un iesniegts materiāls dalībai Eiropas Biotehnoloģijas kongresam Čehijā Prāgā  2022 oktobrī.

30.08.2022.

2022.g. IV ceturksnis 

2022.g. IV ceturksnī turpinājās darbības īstenošana un starprezultātu aprakstīšana. 

Tiek turpināts/pabigts darbs pie izvēlētā Z. mobilis celma(Zm6) ekspresijas sistēmas optimizācijas antimikrobiālo peptīdu producēšanai ieviešot LacUV un T7 promotera sistēmas. Turpināts darbs pie metodes optimizācijas producējamā peptīda R10 (sekvence KKIAKKFWKKFWKFWKIFKK) ekstrakcijai un attīrīšanai ar gēlfiltrācijas metodi, lai samazinātu konjugātu veidošanās apjopmu. Ekspresēto peptīdu aktivitātes tiek salīdzinātas ar kontroles paraugu aktivitātēm pret izvēlētajiem ESCAPE baktēriju celmiem. Iegūtie rezultāti (i) tika prezentēti European Biotechnology Congress 2022,  5-7 Oktobrī Prāgā, Čehija (stenda ziņojums), (ii) tiek apkopoti publicēšanai MDPI  izdevumā Antibiotics. Producēšanai izvēlēto peptīdu darbības raksturošanai tika sekmīgi īstenota to darbības mehanismu izpēte izmantojot fluoriscento iezīmi FITC un konfokālo miukroskopijas metodi. Rezultātā tika apstiprināta producējamo peptīdu membranatropā daba. Iegūtie rezultāti tiek apkopoti publicēšanai MDPI  izdevumā Antibiotics. Ir pabeigts darbs pie ekspresējamo peptīdu citotoksicitātes noteikšanas. Rezultāti tiek apkopoti  publicēšanai MDPI  izdevumā Antibiotics. Papildus ir izplānoti eksperimenti un pabeigts sagatavošanas darbs peptīdu hemoplītiskās  aktivitātes noteikšanai 2023 gada 1 ceturksnī. Tika īstenoti mērogošanas  un optimizācijas  eksperimenti ar mēŗķi iegūt paaugstinātu Z. mobilis biopmasas daudzumu optimālākai peptīdu producēšanai. Lai izvairītos no toksisku starpproduktu veidošanas ir izstrādāts un tiek testēts algoritms aerācijas apstākļu maiņai kultivēšanai pirmsprodukcijas fāzē. 

09.12.2022.

2023.g. I ceturksnis 

2023.g. I ceturksnī ir iesniegta un akceptēta publijkācija par izstrādāto antimikrobiālo peptīdu pielietojumu ādas un mīksto audu infekciju ārstēšanai MDPI izdevumam Antibiotics.

Publikācija: Ramata-Stunda, A.; Boroduskis, M.; Kaktina, E.; Patetko, L.; Kalnenieks, U.; Lasa, Z.; Rubina, M.; Strazdina, I.; Kalnins, G.; Rutkis, R. Comparative Evaluation of Existing and Rationally Designed Novel Antimicrobial Peptides for Treatment of Skin and Soft Tissue Infections. Antibiotics 2023, 12, 551. https://doi.org/10.3390/ antibiotics12030551

Ir pabeigta R10 ekspresijas un attīrīšanas metodikas izstrāde, kas ir pielietojama kā E. coli tā Z. mobilis producēto peptīdu attīrīšanai. Ar masspektrometrijas metodi gūts apstiprinājums pruducētā un pēcāk attīrītā peptīda atbilstībai ķīmiski sintētiskajam analogam. Tika turpināts darbs pie mērogošanas  un optimizācijas  eksperimentiem paaugstinātas Z. mobilis biomasas ieguvei optimālākai peptīdu producēšanai.

Ir uzsākts darbs pie publikācijas sagatvošanas par Z. mobilis paaugstināto rezistenci pret antimikrobiālajiem peptīdiem.

31.03.2022.

2023.g. II ceturksnis  

2023.g. II ceturksnī ir sagatavota publikācija par Z. mobilis paaugstinātās rezistences mehanismiem pret antimikrobiālajiem peptīdiem. Publikācija: Zymomonas mobilis resistance to antimicrobial peptides: an advantage of intrinsically uncoupled energetics. Kalnenieks, U.; Lasa, Z.; Rubina, M.; Strazdina, I.; Kalnins, G.; Rutkis, R. 

Ir veikta eksperimentu sērija uz dermas šūnu paraugiem, kas apstiprina projekta laikā izstrādāatā un biotehnoloģiski producētā antimikrobiālā peptīda R10 efektivitātes atbilstību sintētiskajam analogam. Ir uzsākta publikācijas sagatavošana par šo pētījuma novirzienu. 

Sekmīgi ir īstenots darbs pie mērogošanas  un optimizācijas  eksperimentiem paaugstinātas Z. mobilis biomasas ieguvei optimālākai peptīdu producēšanai. Projekta laikā ir izdevies Z. mobilis šūnas bioreaktoros sakultivēt līdz pat 11,6 gramiem sausnes litrā izmantojot perfūzijas fermentēšanas metodi. (Perfusion fermentation Eng.) 

30.06.2023.