Crypthecodinium cohnii un Zymomonas mobilis sintrofija omega 3 taukskābju ražošanai no biodegvielas un cukura rūpniecības blakusproduktiem

Ir pabeigts DHA ražošanas laboratorijas prototipa (TLG4) apraksts, kurā iekļautas galvenās projekta atziņas, kuras ļauj ražot DHA no cukura rupniecibas blakusprodukta melases un biodīzeļdegvielas ražošanas blakusprodukta glicerīna. Tā kā Z.mobilis nespēj pilnvērtīgi darboties C. cohnii nepieciešamajā sāļajā vidē, fermentācijas sistēma realizēta ar diviem atsevišķiem fermentācijas traukiem, nodrošinot nepieciešamo C. cohnii etanola padevi no trauka, kur etanolu saražojis Z. mobilis.

Prototipā tiek pielietota Z. mobilis imobilizācija algināta lodītēs, kuru izgatavošana, apstrāde un glabāšana ietilpst tehnoloģijas aprakstā. Izstrādāta arerācijas nodrošināšanai nepieciešamā maisīšanas sistēma, kuras ietvaros izvēlēti optimāli maisīšanas instrumenti un atrasts maksimālais liedreīgais griešanās ātrums C. cohnii fermentācijai.

Balstoties uz eksperimentālajiem rezultātiem, ir izstrādāti lipīdu un omega 3 taukskābes izdalīšanas protokoli, kas ir vieni no projekta rezultatīvajiem rādītājiem. Ir pabeigtas C.cohnii heterotrofas kultivācijas bioreaktorā papildus datu ieguvei kultivēšanas dinamikas modelēšanai, kas tika iekļauti zinātniskā raksta manuskriptā, iesniegšanai žurnālā Biotechnology Letters ar nosaukumu "Investigation of Crypthecodinium cohnii high-cell-density fed-batch cultivations".

Ceturkšņa ietvaros veikti projekta publicitātes pasākumi – 2022. gada 25. februārī projekta rezultāti ir prezentēti LU starptautiskajā zinātniskajā konferencē, kā arī Vidzemes Inovāciju nedēļas ietvaros. 2022. gada 16 martā notika projektam veltīts zinātniskais seminārs, kurā visi projekta partneri iepazīstināja ar projekta rezultātiem. Projekts tika prezentēts arī starptautiskā apmācību pasākumā “BioModelling Spring Riga 2022”, kurš notika 22.-24. martā Latvijas Universitātē.

^{Pēdējās izmaiņas veiktas 31.03.2022.}

Balstoties uz izveidotas co-kultivācijas sistēmas prototipa veiktspējas analīzes, tika izstrādāti sistēmas darbības, specifikācijas un komercializācijas potenciāla apraksti. Iepriekš minēta informācija turpmāk tiks pilnībā vai daļēji iekļauta plānotā zinātniskajā rakstā par Z.mobillis un C.cohnii sintrofiskas kultivācijas modelēšanu. Turpinās C.cohnii biomasas augšanas un taukskābes biosintēzes kinētikas precizēšana kultivācijas eksperimentos. 

Rezultāti par C. cohnii augšanas dinamiku un omega 3 taukskābes uzkrāšanos, izmantojot rauga un dinoflageltātu ekstraktus, apkopoti rakstā "Crypthecodinium cohnii Growth and Omega Fatty Acid Production in Mediums Supplemented with Extract from Recycled Biomass" un publicēti žurnālā Marine Drugs (https://doi.org/10.3390/md20010068). Turpinās lipīdu un omega 3 taukskābes izdalīšanas protokolu izstrāde, kā arī tiek veiktas C.cohnii heterotrofas kultivācijas bioreaktorā papildus datu ieguvei kultivēšanas dinamikas modelēšanai.

Izstrādāts C.cohnii centrālā metabolisma modelis, kas iekļauj biomasas ražošanu un ļauj noteikt DHA ražošanas potenciālu izmantojot glikozi, etanolu un glicerīnu kā substrātus. Stehiometriskais modelis ir parametrizēts ar kinētisko modeli, kurš parametrizēts saskaņā ar 13C eksperimentālajiem datiem DHA ražošanai no glikozes. Ir izstrādāta publikācija "Kinetic and stoichiometric modeling-based analysis of docosahexaenoic acid (DHA) production potential by C.cohnii from glycerol, glucose and ethanol” iesniegšanai žurnālā “Marine Drugs”.

^{Pēdējās izmaiņas veiktas 27.12.2021.}

Pabeigta publikācijas sagatavošana par Z. mobilis SacB- mutanta konstruēšanu un tā imobilizētā preparāta pielietojumu saharozes konversijai par aļģes kultivēšanai izmantojamu substrātu. Manuskripts iesniegts publicēšanai Journal of Biotechnology (Elsevier; IF 3.6). Sākta C. cohnii glicerīna asimilācijas ceļa izpēte, lai noskaidrotu, kādi enzīmi tajā iesaistīti, vai ceļš ir inducējams glicerīna klātbūtnē, un kā šī ceļa ekspresiju ietekmē aerācija un citi augšanas vides faktori.  

Publicēts raksts “Syntrophy of Crypthecodinium cohnii and immobilized Zymomonas mobilis for docosahexaenoic acid production from sucrose-containing substrates” žurnālā Journal of Biotechnology (https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2021.07.008). Rezultāti prezentēti arī starptautiskā konferencē "2nd Edition Lipids in the Ocean", 5 – 7 jūlijs 2021, Aveiro, Portugal. Turpināta glicerīna asimilācijas kinētikas izpēte, salīdzinot to ar C. cohnii augšanu uz glikozes un etanola, kā arī miksotrofā režīmā pie dažādām šo substrātu kombinācijām. Iegūtie rezultāti tiek izmantoti centrālā metabolisma kinētiskā modeļa izveidošanai.

C. cohnii metabolisma matemātiskās modelēšanas ziņā tiek parametrizēts metaboliskā ceļa mēroga kinētiskais modelis ar glikozes, etanola un glicerīna substrātiem kombinācijās pa pāriem. Tiek meklēti veidi, kā aprakstīt divu fāzu un vienlaicīga substrātu patēriņa režīmus saglabājot fiksētas Krebsa cikla enzīmu koncentrācijas. Metaboliskais ceļš līdz Acetyl-CoA (acetil-koenzīmam A) ir parametrizēts, tomēr tiek izskatīts arī enzīmu koncentrācijas regulācijas efekts. Turpinās darbs pie C. cohnii  centrālā metabolisma mēroga modeļa izveides un validācijas.

A/S Biotehniskais centrs pabeidza darbu par sintrofiskas kultivācijas sistēmas izveidi. Minētas sistēmas pareizdarbība tika pārbaudīta izmantojot modeļvidi (ūdeni). Minētas procedūras mērķis bija identificēt un izlabot iespējamas vadības algoritma kļūdas un nepilnības. Turpmāk, uzbūvēta sistēma tiks aprobēta reālas ko-kultivācijas procesos ar immobilizēto Z. mobilis un C. cohnii. Tika realizēti vairāki C.cohnii kultivācijas procesi ar mērķī – precizēt biomasas augšanas procesa kinētiskus parametrus (biomasas augšanas ātrums, biomasas iznākums no substrāta, īpatnējais substrata uzņemšanas ātrums). Balstoties uz iegūtiem rezultātiem tika uzbūvēt matemātiskais modelis nepārtrauktām C.cohnii un Z. mobilis ko-kultivācijas procesam. Minētais modelis tiks ņemts par pamatu analizējot ko-kultivācijas sistēmas prototipa mērogošanas potenciālu.

Latvijas Valsts koksnes ķīmijas institūtā tika veiktas un turpinās C.cohnii heterotrofas kultivācijas bioreaktorā, testējot piemērotākos aerācijas režīmus, kā arī veicot pāreju no izmantotā oglekļa avota glikozes uz etanolu, kuru, pēc eksperimentālā uzstādījuma izveides sintrofijai, sintezēs Z. mobilis. Rezultāti par C. cohnii augšanas dinamiku un omega 3 taukskābes uzkrāšanos šūnas barotnēs, izmantojot rauga un dinoflageltātu ekstraktus, prezentēti starptautiskā tiešsaistes konferencē ar postera prezentācijas palīdzību. Turpinās eksperimentu iterācijas, testējot C. cohnii augšanas dinamiku ar komerciāli pieejamo rauga ekstrakta un dinoflageltātu ekstraktiem, kas iegūti no ateļļotas biomasas pēc diviem dažādiem lipīdu ekstrakcijas protokoliem, variējot barotnē pievienoto rauga un dinoflagelāta ekstraktu savstarpējo attiecību.

Pabeigta publikācijas sagatavošana par Z. mobilis SacB- mutanta konstruēšanu un tā imobilizētā preparāta pielietojumu saharozes konversijai par aļģes kultivēšanai izmantojamu substrātu. Manuskripts iesniegts publicēšanai Journal of Biotechnology (Elsevier; IF 3.6). Sākta C. cohnii glicerīna asimilācijas ceļa izpēte, lai noskaidrotu, kādi enzīmi tajā iesaistīti, vai ceļš ir inducējams glicerīna klātbūtnē, un kā šī ceļa ekspresiju ietekmē aerācija un citi augšanas vides faktori.

Uzsākta C. cohnii atsevišķu substrātu patēriņa modelēšana ar metaboliskā ceļa līmeņa kinētisko modeli. Modelis tiek parametrizēts izmantojot glikozes, etanola un glicerīna kā vienīgo substrātu patēriņa eksperimentus. Tiek pieņemts, ka Krebsa cikla enzīmu koncentrācija (izteikt ar Vmax) visos gadījumos ir nemainīga, saskaņā ar Cui et al., (2018) C13 eksperimentālajiem datiem, jo minētajā eksperimentā tika ražota Omega 3 taukskābe DHA. Parametrizācija tiek veikta izmantojot COPASI programmatūru izmantojot neatkarīgo eksperimentu funkcionalitāti. Tiek precizēta centrālā oglekļa metabolisma stehiometriskā modeļa izveide precizējot biomasas komponentes un precizējot alternatīvos metaboliskos ceļus dažādu metabolītu ražošanai.

A/S Biotehniskais centrs tika realizēts veiksmīgs Zymomonas mobilis fermentācijas process ar glikozi kā galveno substrātu. Tika panākta algināta lodīšu stabilitāte pateicoties barotnes pH kontrolei un CaCl₂/KH₂PO₄ koncentrāciju attiecības uzstūrēšanai. Iegūtie kinētiskie dati tiks izmantoti matemātisko modeļu uzbūvē, ka arī sintrofiskas fermentācijas sistēmas darbības metodikas izstrādē. Eksperimentāli tika novērtēts specifiskais etanola uzņemšanas ātrums C. cohnii kultivācijas procesos.

Latvijas Valsts koksnes ķīmijas institūtā tika veiktas un turpinās C.cohnii heterotrofas kultivācijas bioreaktorā, testējot piemērotākos aerācijas režīmus, kā arī veicot pāreju no izmantotā oglekļa avota glikozes uz etanolu, kuru, pēc eksperimentālā uzstādījuma izveides sintrofijai, sintezēs Z. mobilis. Turpinās eksperimentu iterācijas, variējot barotnē pievienoto slāpekļa avotu, testējot C. cohnii augšanas dinamiku ar komerciāli pieejamo rauga ekstraktu un dinoflageltātu ekstraktiem, kas iegūti no ateļļotas biomasas pēc diviem dažādiem lipīdu ekstrakcijas protokoliem. Par C. cohnii augšanas dinamiku un omega 3 taukskābes uzkrāšanos šūnas barotnēs, izmantojot rauga un dinoflageltātu ekstraktus, izveidota postera prezentācija konferencei, kas norisināsies šī gada jūlijā.

Pabeigta publikācijas sagatavošana par Z. mobilis SacB- mutanta konstruēšanu un tā imobilizētā preparāta pielietojumu saharozes konversijai par aļģes kultivēšanai izmantojamu substrātu. Manuskripts iesniegts publicēšanai Journal of Biotechnology (Elsevier; IF 3.6). Sākta C. cohnii glicerīna asimilācijas ceļa izpēte, lai noskaidrotu, kādi enzīmi tajā iesaistīti, vai ceļš ir inducējams glicerīna klātbūtnē, un kā šī ceļa ekspresiju ietekmē aerācija un citi augšanas vides faktori.

Latvijas Universitātes Sistēmbioloģijas grupā turpināta C.cohnii kinētiskā modeļa uzlabošana, papildinot to ar dažādu substrātu reakcijām. Jau esošajiem glikozes un etanola metabolisma ceļiem, pievienotas galaktozes un glicerīna kataboliskās reakcijas. Reakciju tīklu nolemts saīsināt un kā nepieciešamo metabolītu DHA sintēzei norādīt Acetyl-CoA (acetil-koenzīmu A), balstoties uz tā centrālo lomu dažāda garuma taukskābju sintēzē, kas ļaus vieglāk attēlot kopējo taukskābju profilu. Esošā modeļa tīkla papildināšana dos iespēju labāk integrēt eksperimentālos datus un kalpos kā precīzāks pamats turpmāko bioprocesu kinētikas modelēšanas eksperimentiem. Izmantojot iepriekš apstrādātos eksperimentu datus, notiek to integrēšana modelī un  modeļa modifikācijas balstoties uz noskaidrotajām reakciju kinētikas niansēm. Turpināta esošo datu apkopošana un pārveidošana, lai tie vēlāk būtu gatavi publicēšanai.

A/S Biotehniskais centrs tika izveidota jauna imobilizēta Zymomonas mobilis bioreaktora konstrukcija. Iepriekšminētā konstrukcija sevī ietver reaktora trauku, kurā algināta lodītes tiek uzturētas statiska pakojuma konfigurācijā (static packed-bed), lai minimizētu šķīduma plūsmas ietekmi uz alginātu. Izmantojot izveidotu konstrukciju tika realizēti divi fermentācijas eksperimenti, lai noteiktu svarīgākus procesa kinētiskus parametrus. Tika izveidots kultivācijas šķīduma cirkulācijas kontroles moduļa korpuss. Tiek pabeigta C.cohnii kultivācijas šķīduma cirkulācijas kontroles moduļa un bioprocesu kontroliera elektriska montāža. Eksperimentāli tika noteikts minimālais Kolmogorova turbulences mērogs (kultivācijas šķīduma maisīšanas laikā), kurš neizraisa C.cohnii šūnu mehāniskus bojājumus. Minētais parametrs tiks tālāk izmantots procesu modelēšanas nolūkos.

Latvijas Valsts koksnes ķīmijas institūtā tika veiktas un turpinās C.cohnii heterotrofas kultivācijas bioreaktorā, testējot piemērotākos aerācijas režīmus, kā arī veicot pāreju no izmantotā oglekļa avota glikozes uz etanolu, kuru, pēc eksperimentālā uzstādījuma izveides sintrofijai, sintezēs Z. mobilis. Turpinās eksperimentu iterācijas, variējot barotnē pievienoto slāpekļa avotu, testējot C. cohnii augšanas dinamiku ar komerciāli pieejamo rauga ekstraktu un ateļļotas biomasas hidrolizātiem, kas neitralizēti ar kalcija karbonātu vai amonjaka šķīdumu. Tiek veikta taukskābju izdalīšana pēc protokola, kurā iespējams izmantot slapju (centrifugētu vai filtrētu), nevis liofilizētu biomasu.

Pabeigta Z. mobilis ndh-negatīvā celma ģenētiska modifikācija, iegūstot levānsaharāzes (SacB-) mutantu. Pētīta jauniegūtā celma saharozi šķeļošā aktivitāte gan neaugošu šūnu suspensijā, gan šūnās, kas imobilizētas algināta lodītēs. Konstatēts, ka salīdzinot ar izejas cemu, neaugošās SacB- mutanta šūnās saharozes katabolisms norit lēnāk, taču ar augstāku etanola iznākumu, jo visa fruktoze pilnībā pārvēršas etanolā, nevis tiek akumulēta polimēra levāna formā. Ar alginātā imobilizētu SacB- šūnu preparātu etanolā konvertēta saharoze izmantota kā substrāts C. cohnii audzēšanai periodiskajā kultūrā ar piebarošanu. Demonstrēta kultūras augšana un lipīdu uzkrāšanās, kas salīdzināma ar rezultātiem, kuri iegūti par substrātu izmantojot glikozi. Aizsākta publikācijas sagatavošana par SacB- mutanta konstruēšanu un tā imobilizētā preparāta pielietojumu saharozes konversijai par aļģes kultivēšanai izmantojamu substrātu.

Latvijas Universitātes Sistēmbioloģijas grupā tiek veikta kinētiskā modeļa papildināšanai, lai veiktās simulācijas labāk papildinātu stehiometriskā modeļa sniegto informāciju un C.cohnii metabolismu varētu labāk izanalizēt saistībā ar tā spēju izmantot dažādus substrātus DHA ražošanai. Uzsākta līdz šim iegūto rezultātu pirmējā apkopošana. Modelī ievietotas reakcijas, lai tas spētu attēlot ar etanolu veiktos C.cohnii audzēšanas eksperimentus un spētu simulēt etanola uzņemšanu, kas iegūts fermentējot Z.mobilis. Tiek veikta Z. Mobilis stehiometriskā modeļa atbilstoša pielāgošana šobrīd aktuālajai  organismu fermentēšanas stratēģijai. Uzsākta no Latvijas Universitāte iegūto eksperimentālo datu apstrāde, lai precīzi pielāgotu modeļu darbību projektā veiktajiem eksperimentiem.

A/S Biotehniskais centrā tiek veidota ko-fermentācijas sistēmas vadības programmatūra (SCADA), kura sevī ietvers atsevišķo izpildelementu vadību, ka arī tā tiks savienota ar Matlab® programmu, kura ļaus realizēt efektīvu MPC (Model-predictive control) kontroli un veikt fermentācijas procesa analīzi un modelēšanu. Paralēli tiek veidots šķidrumu uzskaites svaru moduļa korpuss un tika izveidota attiecīga vadības programma. Pēc izveides svaru modulis (un vadības programma) tiks aprobēts C.cohnii fermentācijas procesos. Tika veikti Z.mobilis ndh-negatīvā celma fermentācijas procesi 5L laboratorijas bioreaktora, lai identificētu īpatnējo etanola biosintēzes ātrumu un glikozes uzņemšanas ātrumu, kuri tālāk tiks izmantoti procesa modelēšanas nolūkos.

Latvijas Valsts koksnes ķīmijas institūtā tika veiktas un turpinās C.cohnii heterotrofas kultivācijas bioreaktorā, testējot piemērotākos aerācijas režīmus augstāka biomasas iznākuma iegūšanai fermentācijas procesa beigās. Kā arī tiek veikti eksperimenti, variējot barotnē pievienoto slāpekļa avotu, testējot C. cohnii augšanas dinamiku ar komerciāli pieejamo rauga ekstraktu un ateļļotas biomasas hidrolizātiem, kas neitralizēti ar kalcija karbonātu vai amonjaka šķīdumu.

Konstruēts Z. mobilis sucB-negatīvais celms, kuram inaktivēta levānsaharāze, un līdz ar to, patērējot saharozi šis celms neveido fruktozes polimēru levānu. Tā vietā notiek saharozes šķelšana un monomēru konversija etanolā. Veikta mutantā celma šūnu imobilizācija kalcija alginātā. Tika uzsākti un turpinājās pētījumi par imobilizēto šī celma šūnu saharozes patēriņa kinētiku,  kokultivācijas iespējām ar C. cohnii, un vides, kurā imobilizētās šūnas veikušas saharozes konversiju etanolā, izmantošanu par barotni C. cohnii kultivēšanai.

Stehiometriskā un kinētiskā modelēšana tiek izmantota Latvijas Universitātē, lai ar dažādiem matemātiskajiem formālismiem un tajos ietvertajiem organismu fizioloģijas parametriem noskaidrotu atrasto acetilkoenzīma-A ražības ierobežojumu pamatotību. Turpinās gan C. cohnii stehiometriskā, gan kinētiskā modeļa uzlabojumi atbilstoši jaunumiem datu bāzēs un literatūrā. Tiek modelēta Z. mobilis substrāta sastāva iespējamā uzlabošana modificētajam Z. mobilis celmam.

A/S Biotehniskais centrs izveidoja inovatīvu tehnoloģisko risinājumu kultivācijas/fermentācijas šķidruma cirkulācijai (dozēšanai) starp imobilizēto Z.mobilis un C.cohnii bioreaktoriem, kura tiks integrēta kofermentācijas sistēmas gala variantā. Tika identificēti nepieciešamie materiāli un iekārtas, kuras tiks apvienotas kofermentācijas sistēmā un tika uzsākta tirgus izpēte, lai identificētu minēto izejmateriālu potenciālus piegādātājus. Tika uzsākta tehniskā uzdevuma un sistēmas specifikācijas izstrāde, balstoties uz kuriem tiks veidota kofermentācijas vadības un uzraudzības programmatūra, ka arī bioprocesu kontrolieris (kurš sevī ietvers visus nepieciešamus izpildelementus un būtiskas procesa parametru mērīšanas ierīces).

Latvijas Valsts koksnes ķīmijas institūtā turpinās C.cohnii heterotrofa kultivācija kolbās un laboratorijas mēroga bioreaktorā.  Ir izveidota sējmateriāla sagatavošanas un pārsēšanas sistēma, kas samazina aseptisku saskares punktu izveides iestāšanos. Ir izstrādāts lipīdu ekstrakcijas protokols, kas tiek aprobēts, izmantojot uzkrāto biomasu no iepriekšējos periodos veiktajiem fermentācijas procesiem.

Pārskata periodā baktērijās E. coli plazmīdā pGEM sekmīgi klonēts Z. mobilis levānsaharāzes gēns (sacB), tajā insertēts tetraciklīna resistences marķieris tet^r, un ar iegūto konstruktu pGEMsacB:tet^r transformēts Z. mobilis celms ndh. Iegūts rekombinants celms ar inaktivētu levānsaharāzes gēnu (un vienlaikus ar pazeminātu skābekļa patēriņa ātrumu), kura fenotips būtu piemērots saharozes sašķelšanai bez fruktozes polimēra levāna veidošanas, ar tālāku aerobu glikozes un fruktozes konversiju etanolā kokultivācijā ar C. cohnii. Uzsākta šī celma kultivēšana un īpašību izpēte.

Lai papildinātu no stehiometriskā modeļa iegūstamos datus, Latvijas Universitātē uzsākta C. cohnii kinētiskā modeļa veidošana. Veikta nepieciešamo parametru apkopošana un modeļa struktūras izveide. Aprēķināti eksperimentālie dati modeļa darbības pielāgošanai, kā arī nezināmo parametru novērtēšanai. Modelēta glikozes kā substrāta izmantošana C. cohnii kopējo lipīdu sintēzē un modelī ieviests stacionārais stāvoklis. Turpmāk modelim nepieciešams veikt pilnveidojumus, jo pašreiz veiktās simulācijas nespēj sasniegt visu eksperimentāli iespējamo plūsmu lipīdu sintēzes virzienā. Z. mobilis veikta substrāta sastāva optimizācijas modeļa papildināšana, iekļaujot laktozi.

A/S Biotehniskajā centrā tika izveidots un aprobēts Z.mobilis un C.cohnii ko-fermentācijas bioreaktora prototips. Iepriekšminētie mēģinājumi tika realizēti Z.mobilis fermentācijas procesos, kuru mērķis bija noteikt etanola biosintēzes un substrāta (glikozes) uzņemšanas ātrumus. Turklāt, A/S Biotehniskajā centrā tika izveidota automatizēta sistēma (ar attiecīgo programmatūru) šķidrumu cirkulācijai un algināta lodīšu dozācijai/noņemšanai. Turpmāk A/S Biotehniskais centrs vērsīs darbu šķidrumu (piebarošanas šķīduma, titrantu un algināta lodišu) uzskaites/dozācijas sistēmas izveidei. Iepriekšminētā sistēma tiks turpmāk izmantota Z.mobilis un C.cohnii ko-fermentācijas procesos, lai sastādītu attiecīgo masas bilanci un izveidotu piemērotu fermentācijas procesa matemātisko modeli. 

Latvijas Valsts koksnes ķīmijas institūtā tiek veiktas  C.cohnii heterotrofas kultivācijas laboratorijas mēroga bioreaktorā. Procesos iegūtā biomasa tiek uzkrāta lipīdu ekstrakcijai, kam tiek gatavots laboratorijas aprīkojums un no literatūras precizēts atbilstošāks ekstrakcijas protokols, kas tika aprakstīts projekta pieteikuma darbības aprakstos.

Uzsākta Z. mobilis ģenētiska modifikācija: (1) lai izslēgtu fruktozes polimēra levāna veidošanos kas Z. mobilis šūnās notiek paralēli saharozes šķelšanai, un (2) nodrošinātu piena cukura laktozes šķelšanu par glikozi un galaktozi, padarot piena cukuru par izmantojamu substrātu aļģu un Zymomonas kokultivācijai. Pirmā mērķa sasniegšanai tiks inaktivēts enzīms levānsaharāze, kā rezultātā fruktoze netiks saistīta aļģēm nepieejamā polimēra formā, bet tiks konvertēta etanolā, kas ir aļģēm izmantojams substrāts. Otrs mērķis tiks sasniegts, ekspresējot laktozi šķeļošu enzīmu šūnas ārējā (periplazmas) nodalījumā. Iegūtie Z. mobilis celmi tālāk tiks izmantoti imobilizēto algināta preparātu pagatavošanai, un pārbaudīta to efektivitāte, attiecīgi, saharozes un laktozes konversijā.

Par CryZym 1. aktivitāti:

Turpināta Zymomonas mobilis šūnu imobilizācijas procesa optimizācija. Variēti apstākļi kalcija alginātā imobilizēto šūnu preparātu (‘algināta lodīšu’) gatavošanai un salīdzināta iegūto preparātu aktivitāte. Veikts substrātu skrīnings aļģu C. cohnii kultivēšanai: pārbaudīta to spēja augt un akumulēt taukskābes uz barotnēm ar dažādiem cukuriem un dažādām etanola koncentrācijām. Konstatēta C. cohnii spēja augt uz barotnēm ar glikozi, galaktozi un etanolu. Barotnēs ar saharozi, uz kurām C. cohnii tīrkultūras augšana praktiski nenotiek, parādīta iespēja to audzēt kokultivējot ar imobilizētajām Z. mobilis šūnām, kas saharozi konvertē glikozē, fruktozē un tālāk etanolā.

2019. gada 12.-16. augustā Latvijas Universitātes Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas institūts organizēja konferenci par vielmaiņas ceļu analīzi. Konference “Metabolic Pathway Analysis” (MPA2019) pulcēja 120 dalībniekus no 25 valstīm, ieskaitot arī viesus no tālākām valstīm (ASV, Japāna, Dienvidkoreja, Dienvidāfrika un Kolumbija). Konferencē tika prezentēts arī projekts.

Latvijas Universitātē tika turpināta C.cohnii vielmaiņas modelēšana ar stehiometriskā modeļa palīdzību ar programmatūras Merilin un COBRA palīdzību. Pašlaik notiek darbs pie C.cohnii biomasas komponenšu un to proporciju identifikācijas. Ar Z.mobilis stehiometriskā modeļa palīdzību tiek analizētas substrāta komponentes, kas uzlabotu etanola ražošanu.

Latvijas Universitātē tika turpināts darbs pie Z.mobilis NADH dehidrogenāzes-negatīvā celma imobilizēšanas kalcija alginātā, un imobilizēto šūnu preparāta aktivitātes un stabilitātes pētījumiem. Veikta imobilizētā preparāta daļiņu izmēru optimizācija. Vienlaikus tika apgūtas metodikas C.cohnii kultūras uzturēšanai un kultūras sterilitātes kontrolei, kā arī sagatavoti pirmie preparāti biomasas sastāva kontrolei ar FTIR spektroskopijas metodi.

A/S Biotehniskais centrs tika izveidots kofermentācijas sistēmas makets, lai pārbaudītu izvēlētā risinājuma darbības efektivitāti. Uz tehnoloģiskās shēmas maketa tika veikti eksperimenti lai: (1) noteiktu algināta lodīšu padeves/cirkulācijas cauruļvadu optimālos parametrus, (2) izstrādātu un novērtētu sistēmas (vārstu un citu automātikas elementu) darbības algoritmus, algināta lodīšu dozēšanas un recirkulācijas posmiem un (3) novērtētu kofermentācijas bioreaktorā pieļaujamo maisīšanas ātrumu diapazonu, kurā pilnīgi būs novērsta algināta lodīšu sedimentācija un vienlaikus netiks novērota lodīšu nevēlama deformācija (formas izmaiņas).

Latvijas Valsts koksnes ķīmijas institūtā tika veikta un turpinās C.cohnii heterotrofa kultivācija dažādās barotnēs ar mainīgu oglekļa avotu optimālo kultivācijas apstākļu noteikšanai.