Acetaldehīda sintēzes reakcijas pārnese no Zymomonas mobilis šūnas iekšējās telpas uz periplazmu

Pirmās projekta darbības rezultātā iegūtais mutantais celms Z. mobilis-pdc, augot uz glikozes barotnes, producē piruvātu līdz 10 reizēm vairāk, nekā izejas celms. Patlaban otrās darbības ietvaros notiek šī celma uzlabošana, kura ietver: (1) celma transformēšanu ar ekspresijas vektoriem, kuri satur elpošanas ķēdes NADH dehidrogenāzes un laktātdehidrogenāzes gēnus, ar mērķi uzlabot iekššūnas redoks balansu un mazināt laktāta kā blakusprodukta veidošanos; (2) transformēto celmu pakļaušanu selekcijai.
Paralēli, ceturtās darbības ietvaros ir izveidots plazmīdkonstrukts, kurš ļautu ekspresēt Z. mobilis-pdc celmā piruvātdekarboksilāzi ar periplazmatisko signālsekvenci no Z. mobilis ārpusšūnas proteīna levānsaharāzes. Konstrukts patlaban tiek klonēts E. coli un ir nosūtīts DNS sekvences pārbaudei.

Uzsākts darbs pie publikācijas sagatavošanas (3.darbība) par piruvātu producējošo Z. mobilis mutantu, kas iegūts 1. un 2. darbību rezultātā. Tiks aprakstīta Z. mobilis-pdc konstruēšana un transformēšana ar ekspresijas vektoriem, kuri satur elpošanas ķēdes NADH dehidrogenāzes un laktātdehidrogenāzes gēnus, ar mērķi uzlabot iekššūnas redoks balansu, palielināt piruvāta iznākumu, un mazināt laktāta kā blakusprodukta veidošanos.

Ceturtās darbības ietvaros izveidotais plazmīdkonstrukts piruvātdehidrogenāzes gēnam ar periplazmatisko signālsekvenci ir nosekvenēts, ir apstiprināta tā teorētiski sagaidāmā DNS sekvence, un šo konstruktu saturošais E. coli celms līdz jūnija beigām tiks deponēts LU Mikroorganismu kolekcijā.

Iegūtie rezultāti:

Iegūts celms Z. mobilis Pyr. Vecāku celms, kas izmantots konstruēšanā – Zymomonas mobilis pdc-IS1. Genotips – tetraciklīna rezistences inserts piruvātdekarboksilāzes gēnā (ZZ6_1712). Celms iegūts, Zymomonas mobilis pdc-IS1 pakļaujot sērijveida periodiskajai kultivēšanai pakāpeniski pieaugošas intensitātes aerācijas apstākļos. Fenotipiskās pazīmes – par 10 – 20 % paaugstināta piruvāta sintēze un akumulēšana vidē un par 10 % paaugstināts skābekļa patēriņa ātrums, salīdzinot ar celmu pdc-IS1. 

Tetraciklīna rezistence 10 mkg/ml (Z.mobilis barotnē).

Iepriekš izveidots pBBR1MCS-2 plazmīdas konstrukts pBBRgap:sLEV_pdc, kurā starp HindIII un BamHI restrikcijas saitiem ievietots PĶR produkts, kas satur levānsaharāzes periplazmatisko signālsekvenci apvienotu ar piruvātdekarboksilāzes gēna kodējošo daļu.  PĶR produkts iegūts ar sig_LEV_f un PDC_4 praimeriem.  Plazmīdas konstrukts transformēts E. 

coli DH5⍺ un JM110, nosūtīts sekvenēšanai, un saņemti sekvnēšanas dati, kuri apstiprina  konstrukta pareizību. Transformējot ar minēto konstruktu Z. mobilis celmu Zm6, iegūti provizoriski rezultāti, kuri liecina par piruvātdekarboksilāzes ekspresiju periplazmatiskajā telpā. 

Tādēļ konstrukts pBBRgap:sLEV_pdc uzskatāms par funkcionālu pBBR-PeriPDC variantu, un to saturošais E. coli celms Esherichia coli DH5⍺ pBBRgap:sLEV_pdc deponēts LU mikroorganismu kolekcijā.

Abi iegūtie celmi deponēti LU mikroorganismu kolekcijā.

Piektās darbības ietvaros, attīstot un uzlabojot Z. mobilis PeriAc, transformācija tiks veikta arī ar citiem, alternatīviem pBBR-PerPDC variantiem. Gadījumā, ja tiks iegūts funkcionāli efektīvāks pBBR-PerPDC variants, ar to tiks nomainīts šobrīd deponētais E. coli celms.

Izmantojot ceturtās darbības ietvaros iegūto plazmīdkonstruktu piruvātdekarboksilāzes gēnam ar periplazmatisko signālsekvenci, iegūts Z. mobilis celma PeriAc pirmais variants un uzsākta tā augšanas un metabolisma izpēte. Pabeigta trešā darbība - publikācijas gatavošana par piruvātu producējošo Z. mobilis PDC negatīvo mutantu, ietverot tajā arī pirmos datus par Z. mobilis celmu PeriAc, kurš ekspresē PDC periplazmā.

Pabeigta Projekta 3. darbība un sasniegts plānotais darbības rezultāts - sagatavota publikācija par piruvātdekarboksilāzes mutanto celmu īpašībām, ietverot tajā arī pirmos datus par jauniegūto celmu PeriAc: "Translocation of Zymomonas mobilis pyruvate decarboxylase to periplasmic compartment for production of acetaldehyde outside the cytosol" un manuskripts iesniegts žurnālā 'Microbial Biotechnology' 30.09.2018
Īstenojot Projekta 5. darbību iegūts celms Z. mobilis PeriAc, celmu Z. mobilis-pdc transformējot ar plazmīdkonstruktu pBBR-PeriPDC, kurā zem Pgap promotera tiek ekspresēta piruvātdekarboksilāze ar periplazmatisko signālsekvenci no enzīma glukonolaktonāzes.

Konstatēta funkcionālas PDC ekspresija periplazmatiskajā telpā.

Par šiem rezultātiem oktobrī ziņots starptautiskās konferencēs (2 mutiski referāti un 3 stenda ziņojumi). Tiek turpināta iegūtā celma izpēte un kultivēšanas apstākļu optimizācija.

Īstenojot projekta 5. darbību, konstruēts celms Z. mobilis PeriAc ar šūnas periplazmā lokalizētu acetaldehīda sintēzes aktivitāti. Iegūtais celms deponēts LU mikroorganismu kolekcijā un uzsākta tā augšanas un metabolisma izpēte. Sagatavots un iesniegts publicēšanai manuskripts par piruvātdekarboksilāzes mutanto celmu PDC- un PeriAc konstruēšanu un to īpašībām: "Translocation of Zymomonas mobilis pyruvate decarboxylase to periplasmic compartment for production of acetaldehyde outside the cytosol". Par darba rezultātiem oktobrī ziņots Ķīnā (U. Kalnenieks kā uzaicinātais lektors piedalījās konferencē 'The 2nd International Symposium on Zymomonas mobilis: Metabolic Engineering and Synthetic Biology', Wuhan, Oct 18-22), Francijā (mutisks referāts un stenda ziņojums konferencē "4th Applied synthetic biology in Europe", Toulouse, Oct 23-27), kā arī starptautiskā Biotehnoloģijas konferencē Ungārijā, Budapeštā (2 stenda ziņojumi). 12. decembrī par šiem rezultātiem ziņots 3. Igaunijas-Latvijas sistēmbioloģijas seminārā Tartu Universitātē.

Projektā uzsākta 9. darbība - acetaldehīda periplazmatiskās sintēzes matemātiskā modeļa veidošana.

Projekta otrā gada noslēgumā un trešā gada pirmajā ceturksnī turpinājās darbs pie Z. mobilis celma PeriAc īpašību uzlabošanas. PeriAc celms daļu no enzīma piruvātdekarboksilāzes ekspresē nevis šūnas iekšienē, bet periplazmā – perifērajā telpā starp šūnas iekšējo un ārējo membrānu. Piruvātdekarboksilāzes reakcijā no piruvāta veidojas mērķprodukts, gaistošais bet šūnām toksiskais savienojums acetaldehīds. Tā kā tas PeriAc celmā tiek sintezēts pārsvarā periplazmā, nevis šūnas iekšējā telpā, tad enerģiski aerējot kultūru to ir vieglāk aizvadīt no vides, un tādejādi mazāk tiek inhibēts šūnas metabolisms. PeriAc aerētā kultūrā tas izpaužas kā producentam vēlamas īpašības: paaugstināts acetaldehīda iznākums un palielināta biomasas augšana. Taču, kā iespējamais limitējošais posms acetaldehīda sintēzē periplazmā varētu būt lēns piruvāta eksports no šūnas, nepietiekami nodrošinot periplazmatisko piruvātdekarboksilāzi ar substrātu. Lai pastiprinātu piruvāta eksportu uz periplazmu, PeriAc un PDC- celmos ekspresēsim piruvāta transmembrānas transporta sistēmu no baktērijas Rhizobium etlii. Pašreiz norit DNS molekulārā klonēšana un attiecīgo Z. mobilis celmu transformēšana ar vektoru, kurš satur transportsistēmas gēnu.
Transformētajos celmos pētīsim piruvāta eksportu un akumulēšanos vidē (PDC- celmā) un acetaldehīda sintēzi (PeriAc), cerot uz šo procesu paātrināšanos.

Projekta trešā gada otrajā ceturksnī turpinājās darbs Projekta 6., 7. un 9. aktivitātes. 

2019.gada augustā iesniegtā publikācija “Metabolic engineering of bacterial respiration: high versus low P/O and the case of Zymomonas mobilis” (Uldis Kalnenieks, Elīna Balodīte, Reinis Rutkis), novembrī tika publicēta žurnālā “Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, section Synthetic Biology”, pieejams: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fbioe.2019.00327/full

Noslēdzās darbs arī pie celma Z. mobilis PeriAcRes, kurš tika deponēts LU mikroorganismu kolekcijā.

Projekts noslēdzās 2020. gada martā, tajā plānotie rezultāti sasniegti.

Noslēdzās darbs pie datormodeļa pilnveidošanas. Modelis iesniegts BioModels datubāzē, identifikācijas Nr. MODEL2004130001.

Noslēdzās darbs pie publikācijas par acetaldehīdu producējošā un acetaldehīderezistentā celma metabolismu un metabolomiku. Publikācija: "Metabolic profiling of glucose-fed metabolically active resting Zymomonas mobilis strains", Fuchino K., Kalnenieks U., Rutkis R., Grube M., and Bruheim P. (2020)

Noslēdzās darbs pie publikācijas par datormodeļa izveidi un modelēšanas rezultātiem. Sagatavots un iesniegts manuskripts ‘Frontiers in Bioengineering and Biotechnology’.

Sagatavots un iesniegts Projekta noslēguma ziņojums.