Jauns cilvēka aizkuņģa dziedzera organoīdu modelis reģenerācijas un slimību pētījumiem

Projekta nosaukums: Jauns cilvēka aizkuņģa dziedzera organoīdu modelis reģenerācijas un slimību pētījumiem

Projekta līguma numurs: 1.1.1.2/VIAA/4/20/623

Projekta vadītājs (pēcdoktorants): pētnieks, Dr. pharm. Vadims Parfejevs

Projekta īstenošanas termiņš: 01.01.2021.-30.06.2023.

Projekta kopējais finansējums, LU daļa: 111,504.90 EUR, LU daļa: 5,575.25 EUR

Projekta mērķis: Izveidot cilvēka aizkuņģa dziedzera organoīdu modeli lai kopkultūrās pētītu dziedzera epitēlija un stromas šūnu mijiedarbību.

Projekta rezultāti: 1 iesniegta publikācija, 2 starptautisku zinātnisku konferenču tēzes, 1 mobilitātes komandējums, 2 vadīti maģistra darbi.

I ceturksnis (01.01.2021 – 31.03.2021):

• Ir saņemta ētikas atļauja cilvēka aizkuņģa dziedzera paraugu iegūšanai.
• Ir izaudzētas šūnas, kas veido organoīdu kultivēšanai nepieciešamos proteīnus WNT3A un RSPO1. Savāktas un iesaldētas barotnes, kas satur šos proteīnus. Pārbaudīta šo proteīnu koncentrācija un tā ir organoīdu kultivēšanai pieļaujamajās robežās.
• Švāna šūnu līnija ir raksturota ar imūnfenotipēšanas un polimerāzes ķēdes reakcijas metodēm.
• Līdzīgi pavairota un sasaldēta komerciāla MSŠ šūnu līnija un noteikts, ka šīs šūnas ekspresē tām raksturīgos marķierus un diferenciācijas testā uzrāda sagaidāmos rezultātus.
• No Paula Stradiņa slimnīcas saņemts pirmais klīniskais paraugs. Veikta šūnu izdalīšana un kultivēšana. Kultivēšanas mēģinājums nav veiksmīgs, kas, iespējams, saistīts ar zemo dziedzera kanāliņu šūnu skaitu paraugā.

II ceturksnis (01.04.2021 – 30.06.2021):

• Izmantojot peļu audus, atstrādāts protokols mezenhimālo šūnu izdalīšanai no aizkuņģa dziedzera audiem.
• Izveidota cilvēka aizkuņģa dziedzera veselo audu organoīdu kultūra.
• Sadarbībā ar Traumatoloģijas un Ortopēdijas slimnīcu izveidots un Centrālai medicīnas ētikas komitejai iesniegts projekta pieteikums šūnu līniju (Švāna šūnu un fibroblastu) iegūšanai no cilvēka perifērajiem nerviem.
• Sadarbībā ar Austrumu Slimnīcas ārstiem izveidots un Centrālai medicīnas ētikas komitejai iesniegts projekta pieteikums organoīdu un mezenhimālo šūnu līniju izveidošanai no cilvēka aizkuņģa dziedzera pēcoperāciju audu paraugiem.
• Veikta aizkuņģa dziedzera epiteliālo marķieru noteikšana cilvēka organoīdu kultūrā.
• Apgūti tiešsaistes datu analīzes kursi Galaxy platformā un iegūts sertifikāts.

2022. gada 1 ceturksnis (01.01.2022 – 31.03.2022)

• Pavairotas cilvēka Švāna šūnas un veikta to attīrīšana no fibroblastiem. Nerva fibroblasti tiek atsevišķi pavairoti.
• Tiek ievāktas barotnes no primārajām cilvēka Švāna šūnu kultūrām un kaulu smadzeņu mezenhimālo stromas šūnu līnijas. Šis barotnes ir plānots izmantot proteomikas analīzēm, lai noteiktu skretēto proteīnu profilu.
• Sadarbībā ar Rīgas Austrumu Klīniskās Universitātes Slimnīcas ārstiem tika izveidotas vēl 3 cilvēka aizkuņģa dziedzera organoīdu līnijas.
• Notiek darbs pie iegūto līniju raksturošanas. Izveidotas līnijas tiek fenotipiski raksturotas izmantojot aizkuņģa dziedzera epitēlijam raksturīgos biomarķierus. Fenotipiska raksturošana tiek veikta ar imūnfluorescences metodi izmantojot "whole-mount" pieeju un sasaldēto šūnu griezumus.
• No šūnu līnijām tiek ievākts RNS un DNS materiāls turpmākai raksturošanai.
• Tiek izmēģināti dažādi kopkultūru izveidošanas paņēmieni un noteiktas barotņu sastāva prasības.

2022. gada 2 ceturksnis (01.04.2022 – 30.06.2022)

• Tiek veikti meklēti optimālie kopkultivēšanas apstākļi. Veikti kopkultivēšanas eksperimenti ar Švāna šūnām, kaula smadzeņu mezenhimālajām šūnām un nerva fibroblastiem.
• Apkopoti rezultāti par kopkultivēšanas ietekmi uz organoīdu skaitu un izmēriem, ievākti paraugi imūnfluorescences analīzei un barotnes sekretēto proteīnu analīzei.
• Tiek veikti mēģinājumi izdalīt šūnas no kopkultūrām ar magnētiskās sortēšanas un plūsmas citometrijas sortēšanas paņēmieniem. Nepieciešama protokolu optimizēšana.
• Sadarbībā ar Rīgas Austrumu Klīniskās Universitātes Slimnīcas ārstiem tika izveidotas vēl četras cilvēka aizkuņģa dziedzera organoīdu līnijas. Izveidotas līnijas tiek fenotipiski raksturotas izmantojot aizkuņģa dziedzera epitēlijam raksturīgos biomarķierus. No šūnu līnijām tiek ievākts RNS un DNS materiāls turpmākai raksturošanai.
• Informācija par projektu un tā rezultātiem tiek izplatīta piedaloties CorEuStem COST akcijas vadības komitējas sēdē.
• Manā vadībā projekta tēmas ietvaros LU MF ir izstrādāti divi noslēguma darbi (1 maģistra, 1 bakalaura).

2022. gada 3 ceturksnis (01.07.2022 – 30.09.2022)

• Turpināts darbs pie izveidoto aizkuņģa dziedzera organoīdu kultūru raksturošanas – jaunizveidoto līniju imūnfluorescences analīzes.
• Iesniegti DNS paraugi mērķētai DNS sekvencēšanas analīzei.
• Turpināts darbs pie šūnu sortēšanas protokola optimizēšanas pēc nervu sistēmas un aizkuņģa dziedzera šūnu kopkultivēšanas gelā.
• Iesniegti barotņu testa paraugi proteomikas analīzes apstākļu optimizēšanai. 
• Informācija par projektu un tā rezultātiem tiek izplatīta piedaloties Zinātnieku Nakts 2022 aktivitātēs.
• Attēlā aizkuņģa dziedzera organoīdi ar fibroblastiem un Švāna šūnām uz to virsmas (zāļā krāsā)

2022. gada 3 ceturksnis (01.07.2022 – 30.09.2022)

• Turpināts darbs pie izveidoto aizkuņģa dziedzera organoīdu kultūru raksturošanas – jaunizveidoto līniju imūnfluorescences analīzes.
• Iesniegti DNS paraugi mērķētai DNS sekvencēšanas analīzei.
• Turpināts darbs pie šūnu sortēšanas protokola optimizēšanas pēc nervu sistēmas un aizkuņģa dziedzera šūnu kopkultivēšanas gelā.
• Iesniegti barotņu testa paraugi proteomikas analīzes apstākļu optimizēšanai. 
• Informācija par projektu un tā rezultātiem tiek izplatīta piedaloties Zinātnieku Nakts 2022 aktivitātēs.
• Attēlā aizkuņģa dziedzera organoīdi ar fibroblastiem un Švāna šūnām uz to virsmas (zāļā krāsā).

2022. gada 4 ceturksnis (01.10.2022 – 31.12.2022)

• Ir izveidotas vēl 5 cilvēka aizkuņģa dziedzera organoīdu līnijas.
• Iegūtās līnijas tiek raksturotas ar imūnfluorescences metodēm.
• Turpināts darbs pie datu ievākšanas no kop-kultivēšanas eksperimentiem.
• Optimizēti apstākļi šūnu iegūšanai no gēla un šķirošanai ar plūsmas citometru - ir iegūts pietiekoši daudz šūnu lai varētu izdalīt RNS priekš sekvenēšanas.
• Kopā ar partneriem no uzņemošās laboratorijas ir izplānoti eksperimenti, kas tiks veikti mobilitātes ietvaros.
• Mobilitātes ietvaros Ulmas universitātē Aleksandra Klegera grupā tiek apgūta aizkuņģa dziedzera eksokrīno un endokrīno šūnu diferenciācija no pluripotentajām cilmes šūnām.
• Ir veikti kop-kultivēšanas eksperimenti ar aizkuņģa dziedzera priekštečšūnām un stromas šūnām.
• Klegera laboratorijā apgūta jauna metode - šūnu kultivēšana uz cūku urīnpūšļa epitēlijaudu matricām.
• Pēcdoktorantūras pētījuma rezultāti ir prezentēti Ulmas Universitātes Internās medicīnas nodaļas seminārā.

2023. gada 1 ceturksnis (01.01.2023 – 31.03.2023)

Turpināts darbs pie aizkuņģa dziedzera organoīdu kultūru izveidosanas un raksturošanas – izveidotas papildus 2. līnijas un veiktas imūnfluorescences analīzes.

Ulmas Universitātē tiek pabeigti eksperimenti ar šūnu kopkultūrām un pluripotento šūnu diferenciāciju, tiek sagatavoti paraugi sūtīšanai uz turpmāko analīzi Latvijā;

Noslēdzies 2. mēnešus garš komandējums (14.11.2022 - 15.01.2023). Mobilitātēs laikā apgūta pluripotento šūnu kultivēšanas metodoloģija veikta virkne kopkultūru eksperimentu un iegūti daudzi paraugi, kuru analīze turpināsies Latvijā;

• Ar imūnfluorescences metodēm tiek raksturoti Ulmas universitatē izveidotie kopkultūru paraugi;
• Veikta iegūto rezultātu kvantifikācija un iegūto datu apspriede ar kolēģiem no Ulmas universitātes;
• Izveidots standartprocedūras metodoloģiskais apraksts organoīdu kultivēšanai un kopkultūru izveidošanai;
• Farmācijas Bakalaura studiju programmas studentiem prezentēta lekcija par mērķētām audzējterapijas pētījumiem, tai skaita izmantojot organoīdus ka pirmsklīniskos modeļus;
• Veikti papildus kopkultūru eksperimenti, lai savāktu pietiekoši daudz materiāla priekš transkriptomikas analīzes;
• Lai noteiktu iegūto šūnu līniju audzēja statusu veikta iegūto paraugu mērķēta DNS sekvenēšana;
• No iegūtiem paraugiem izdalīts RNS un sagatavotas bibliotēkas priekš RNS pilna transkriptoma sekvenēšanas;