Biotehnoloģiskie risinājumi mērķsavienojumu kontrolei melnajā plūškokā Sambucus nigra in vitro šūnu kultūrās un in planta, izmantojot endofītiskos mikroorganismus.

Projekta nosaukums: Biotehnoloģiskie risinājumi mērķsavienojumu kontrolei melnajā plūškokā Sambucus nigra in vitro šūnu kultūrās un in planta, izmantojot endofītiskos mikroorganismus.

Projekta līguma numurs: 1.1.1.2/VIAA/2/18/256
Projekta sadarbības partneri : Vides risinājumu institūts 
Projekta īstenošanas termiņš: 1.04.2019. – 31.03.2022.
Projekta kopējais finansējums, LU daļa: 133805.88, 6690.31
Projekta mērķis: Pārbaudīt hipotēzi, ka, kontrolējot melnā plūškoka Sambucus nigra endofītiskos mikroorganismus, iespējams mērķtiecīgi ietekmēt farmakoloģiski nozīmīgu savienojumu kvalitatīvo un kvantitatīvo saturu šajā ārstniecības augā.
Projekta rezultāti: projektā plānots sagatavot 2 zinātniskās publikācijas, 2 tehnoloģijas, kā arī 6 mēnešu mobilitātes ietvaros stažēties reģiona vadošajās zinātniskajās institūtcijās augu biotehnoloģijas jomā.

Laika periodā no 04.2019. – 30.06.2019.

Darbs pie WP1:

• Atskaites periodā ievākti melnā plūškoka ziedu paraugi mērķsavienojumu analīzei no 15 vietām (vairāk nekā 70 paraugu).
• Ievākti lapu paraugi DNS izdalīšanai, kas turpmāk nepieciešama Latvijā augošo melno plūškoku filoģenetiskajām analīzēm.

Darbs pie WP2:

• Uzsākts darbs pie melnā plūškoka in vitro dzinumu kultūru iegūšanas- izmēģināta paraugu priekšapstrāde ar fungicidālas iedarbības preparātiem kultūru infekcijas novēršanai.

Darbs pie WP4:

1. Veikta eksperimentu sērija optimālas paraugu sterilizēšanas metodes izstrādei – katram melnā plūškoka ievākto audu veidam veikti izmēģinājumi ar trim sterilizēšanas ilgumiem, izvērtētas divas paraugu dezintegrācijas metodes, kā arī izmantojot agrobaktēriju infiltrāciju, izvērtēta sterilizēšanas un endofītu izdalīšanas efektivitāte. Apgūta metodika paraugu sterilizēšanas efektivitātes pārbaudei.

2. Atskaites periodā uzsākta paraugu ievākšana metagnomikas analīzēm. Ievākti melnā plūškoka ziedpumpuru, ziedu, lapu, sakņu un augļu paraugi no trim savvaļas augtenēm, veikta šo paraugu sterilizēšana un ieglabāšana turpmākiem metagenomikas pētījumiem.

Komunikācijas aktivitātes:

1. Vikipēdijā izveidots šķirklis „Endofīti”

2. Izveidota projekta Facebook lapa, kurā ievietotā informācija atspoguļo projekta aktuālās aktivitātes.

3. Sabiedrības iesaiste plūškoku augšanas vietu apzināšanā, izmantojot projekta Facebook lapu.

Laika periodā no 1.07.2019. – 31.09.2019.

Darbs pie WP1:

• Atskaites periodā ievākti melnā plūškoka ogu paraugi mērķsavienojumu analīzei no 21 S.nigra izplatības vietas (vairāk nekā 90 paraugu).

Darbs pie WP2:

• Iegūtas melnā plūškoka in vitro dzinumu kultūras. Uzsākts darbs pie kallusu kultūru iegūšanas – veikti izmēģinājumi ar dažādām fitohormonu koncentrācijām un eksplantu variantiem kalloģenēzes inducēšanai.

Darbs pie WP4:

1. Izstrādāta efektīva metode S.nigra sakņu paraugu sterilizācijai.

2. Izstrādāts protokols S.nigra audu bagātināšanai ar endofītisko baktēriju šūnām, kas turpmāk būs nepieciešams gan kultivējamo endofītu izdalīšanai, gan metagenomikas analīzēm.

3. Atskaites periodā pabeigta paraugu ievākšana metagnomikas analīzēm. Ievākti melnā plūškoka augļu paraugi trīs attīstības stadijās un lapas – divās attīstības stadijās un sakņu paraugi no trim savvaļas augtenēm, veikta šo paraugu sterilizēšana un ieglabāšana turpmākiem metagenomikas pētījumiem.

Komunikācijas aktivitātes:

Projekta aktivitāšu popularizēšana Eiropas zinātnieku naktī 2019.

 

Laika periodā no 1.10.2019. – 31.12.2019.

Darbs pie WP1:

Atskaites periodā pārbaudītas dažādas metodes paraugu priekšapstrādei, lai sekmīgi veiktu ogu liofilizāciju.

Darbs pie WP2:

Atskaites periodā divu mēnešu garumā veikta stažēšanās Somijas Tehnisko pētījumu centrā VTT, kur izstrādāts S.nigra kallusu kultūru iegūšanas protokols, kā arī apgūts darbs ar augu šūnu kultūrām un veikti pirmie eksperimenti augu šūnu un mikroorganismu kokultivēšanas metodikas izstrādei. Apgūta mikroorganismu inkapsulācija algināta kapsulās.

Darbs pie WP3:

Uzsākts darbs pie piemērotākās metodikas izvēles mikroorganismu izdalīšanai no plūškoku audu paraugiem- tiek salīdzinātas 3 izdalīšanas metodes- eksplantu metode, atšķaidīšana līdz zemākajam detekcijas līmenim un apstrāde ar šūnapvalku degradējošiem enzīmiem.

Darbs pie WP4:

Uzsākts darbs pie kontroles mikrobioma parauga sagatavošanas, izdalot kultivējamos mikroorganismus no S.nigra audiem.

Mobilitāte: Stažēšanās Somijas Tehnisko pētījumu centrā VTT.

Laika periodā no 1.01.2020. – 31.03.2020.

Darbs pie WP1:

Sagatavoti ekstrakti no liofilizētajiem ogu paraugiem (>nekā 100 ekstraktu), veikta to kopējo polifenolu daudzuma, anti-radikālās aktivitātes un kopējo flavonoīdu satura noteikšana- nepieciešams turpmākajā pētījumā izmantojamo augu atlases pamatošanai.

Darbs pie WP2:

1. Turpināts darbs pie kallusu un dzinumu kultūru uzturēšanas (šobrīd kallusu kultū®as tiek uzturētas uz 3 dažādām barotnēm – uz katras vismaz 10 paraugu).

2. Veikta kallusu kultūru ekstraktu sagatavošana un to kopējo fenolu un anti-radikālās aktivitātes noteikšana.

3. Projektā sasniegtie rezultāti prezentēti Latvijas Universitātes ikkadējā zinātniskajā konferencē.

Darbs pie WP3:

1. Izdalītas mikroskopiskās sēnes un baktērijas no ogām 1.attīstības stadijā no 3 populācijām (katra 10 augu), izmantojot 3 izdalīšanas metodes (90 paraugi).

2. Iegūtas tīrkultūras no izdalītajiem mikroorganismiem, tās ieglabātas Latvijas Mikroorganismu kultūru kolekcijā.

Darbs pie WP4:

Turpināts darbs pie kontroles mikrobioma parauga sagatavošanas, izdalot kultivējamos mikroorganismus no S.nigra audiem.

Darbs pie WP5:

Ierīkots S.nigra stādījums, kuru plānots izmantot inficēšanas eksperimentos.

Laika periodā no 1.04.2020. – 30.06.2020.

Darbs pie WP1:

Balstoties uz 5 dominējošo ķīmisko savienojumu kvantitatīvo saturu ogu ekstraktos, kā arī kopējo polifenolu, kopējo flavonoīdu un anti-radikālās aktivitātes rādītājiematlasītas turpmākajā pētījumā izmantotās augu populācijas.

Darbs pie WP2:

1. Turpināts darbs pie kallusu un dzinumu kultūru uzturēšanas.

2. Uzsākta ievadīšana šūnu kultūrā.

3. Publicētas LU konferences ziņojuma tēzes – pieejamas: http://eeb.lu.lv/EEB/202003/EEB_XVIII_abstracts.pdf

Darbs pie WP3:

Ievākti, sterilizēti un apstrādāti ar mikroorganismu izdalīšanas metodēm ziedpumpuru, lapu un ziedu paraugi no 3 populācijām (48 paraugi).

Darbs pie WP4:

Ievākti, sterilizēti un  ieglabāti ziedpumpuru un 1. stadijas lapu paraugi no 20 S.nigra savvaļas populācijām (100 augu), ievākti, sterilizēti un ieglabāti ziedu un 2. stadijas lapu paraugi no 3 populācijām.

Darbs pie WP5:

Veikta S.nigra spraudeņu apsakņošana, kurus paredzēts turpmāk izmantot mākslīgo infekciju eksperimentos.

1.07.2020. – 30.09.2020.

Darbs pie WP1:

Sagatavota un iesniegta publicēšanai publikācija par S. nigra savvaļas populāciju fitoķīmisko raksturojumu.

Darbs pie WP2:

1. Turpināts darbs pie kallusu un dzinumu kultūru uzturēšanas.

2. Izveidotas S.nigra in vitro šūnu suspnesiju kultūras.

3. Sagatavots tehnoloģiskais apraksts S.nigra šūnu kultūru iegūšanai.

Darbs pie WP3:

Ievākti, sterilizēti lapu, nobriedušu nenogatavojušos ogu un nogatavojušos paraugi no 2 populācijām (30 paraugu). Ievāktajiem paraugiem arī veikta gan mikroskopisko sēņu, gan baktēriju izolēšana.

Darbs pie WP4:

Ievākti, sterilizēti un ieglabāti lapu, nobriedušu nenogatavojušos ogu un nogatavojušos paraugi no 2 populācijām (30 paraugu), kā arī nogatavojušos ogu paraugi no 20 S.nigra savvaļas populācijām (100 augu),

Darbs pie WP5:

Veikta S.nigra augu un S.nigra kultūru uzturēšana, kuras paredzēts turpmāk izmantot mākslīgo infekciju eksperimentos.

 

01.10.2020.–31.12.2020.

Darbs pie WP1:

Veikti papildus eksperimenti, lai sagatavotu atbildes uz recenzentu iebildēm publikācijai par S. nigra savvaļas populāciju fitoķīmisko raksturojumu, sagatavots un atkārtoti iesniegts publikācijas manuskripta labojums.

Darbs pie WP2:

S.nigra kallusu, dzinumu un šūnu suspensiju kultūru uzturēšana – regulāra visa audu materiāla pārstādīšana tiek veikta ik 2 nedēļas.

Veikti eksperimenti, lai noskaidrotu optimālu šūnu materiāla iesvaru šūnu kultūru uzturēšanai (eksperimentu sērijā pārbaudīti 4 dažādi iesvari), uzsākti eksperimenti, lai noskaidrotu optimālu šūnu agregātu izmēru (eksperimentu sērijā pārbaudīti 3 dažādi agregātu izmēri) S.nigra šūnu kultūru produktivitātei.

Mobilitātē Vides Risinājumu institūtā veikta S.nigra kallusu kultūru ekstraktu ķīmiskā sastāva analīze ar HPLC.

Darbs pie WP3:

Veikta izolēto mikroskopisko sēņu pārstādīšana tīrkultūrā. Analizēta izdalīto sēņu celmu koloniju morfoloģija un mikroskopiska identifikācija, lai noteiktu taksonomisko piederību. Kopā analizētas un raksturotas vairāk nekā 600 sēņu tīrkultūru, izveidota analizēto paraugu datubāze. Raksturotie paraugi ieglabāti ilgtermiņa glicerola kultūrās pie -80 °C, izveidojot vēlākiem pētījumiem pieejamu S.nigra endofītisko sēņu kolekciju.

Darbs pie WP4:

Uzsākta S.nigra paraugu dezintegrācija, lai sagatavotu paraugus DNS izdalīšanai pirms mikrobioma analīzes ar augstas-caurlaides amplikona sekvencēšanu.

Darbs pie WP5:

Veikta S.nigra augu un S.nigra kultūru uzturēšana, kuras paredzēts turpmāk izmantot mākslīgo infekciju eksperimentos. Balstoties uz eksperimentiem, kas veikti 3. atskaites periodā mobilitātē Somijas VTT tehnisko pētījumu centrā, sagatavots S.nigra kopējās mikrobiotas mikro-inkapsulācijas protokols.

 

1.01.2021.–31.03.2021.

Darbs pie WP1:

Nopublicēta publikācija par S.nigra Latvijas populāciju izcelšanos, ziedu un ogu fitoķīmiskām īpašībām un in vitro anti-virālām īpašībām.

Darbs pie WP2:

S.nigra kallusu, dzinumu un šūnu suspensiju kultūru uzturēšana – regulāra visa audu materiāla pārstādīšana tiek veikta ik 2 nedēļas.

Eksperimentāli noteikta S.nigra šūnu kultūru augšanas līkne, raksturojot šūnu biomasas pieaugumu desmit laika punktos vairākos bioloģiskajos atkārtojumos. Šie dati nepieciešami, lai izvēlētos augu-mikroorganismu ko-kultivēšanas eksperimentos optimālu kultūru inficēšanas laiku.

Darbs pie WP3:

Veikta datu analīze par iepriekš izolēto mikroskopisko sēņu morfotipiem, noteikta izolēto mikroskopisko sēņu sabiedrību daudzveidība dažādos S.nigra audu tipos, dažādās S.nigra populācijās un divās eksperimentālajās sezonās. Atrastās likumsakarības ziņotas LU ikgadējā zinātniskajā konferencē (ziņojuma tēzes pieejamas ŠEIT).

Darbs pie WP4:

Veikta S.nigra ogu, ziedu un sakņu paraugu dezintegrācija un kopējās DNS izdalīšana, pārbaudīta izdalītās DNS kvalitāte un piemērotība polimerāzes ķēdes reakcijas veikšanai gan ar mikrospkopiskām sēnēm specifiskiem praimeriem, gan praimeriem, kas amplificē gan augu, gan sēņu sekvences. Tādējādi nosakot augu-sēņu DNS proporciju paraugos, lai pārliecinātos par sagatavoto paraugu piemērotību tālākai analīzei ar augstas-caurlaides amplikona sekvencēšanu. Sagatavoti augu sekvnecei specifiskas PĶR bloķētājzondes, izmēģināta to efektivitāte saimniekorganisma DNS amplifikācijas bloķēšanai.

Darbs pie WP5:

Veikta S.nigra augu un S.nigra kultūru uzturēšana, kuras paredzēts turpmāk izmantot mākslīgo infekciju eksperimentos.

1.04.2021. – 30.06.2021.

Darbs pie WP1:

Aktivitāte pabeigta.

Darbs pie WP2:

S.nigra kallusu, dzinumu un šūnu suspensiju kultūru uzturēšana – regulāra visa audu materiāla pārstādīšana tiek veikta ik 2 nedēļas.

Uzsākta virtuālā mobilitāte pie partnerinstitūcijas- Somijas Tehnisko pētījuma centrā VTT, ar mērķi sagatavot kopīgu publikāciju. Uzsākta datu analīze publikācijai par S.nigra šūnu kultūrām.

Darbs pie WP3:

Ievākti ziedu paraugi no divām savvaļas S.nigra populācijām, izdalīts kopējais mikrobioms WP5 aktivitātēm, no šiem paraugiem izolētas mikroskopiskās sēnes un baktērijas.

Projekts prezentēts Eiropas zinātnieku naktī 2021.

Darbs pie WP4:

Veikta 200 S.nigra paraugu (no dažādiem audu tipiem un dažādām savvaļas populācijām) variablā ITS reģiona sekvencēšana ar jaunās paaudzes sekvencēšans tehnoloģiju endofītisko sēņu daudzveidības analīzei.

Dalība Eiropas molekulārās bioloģijas organizācijas (EMBO) apmācībās par mikrobioma datu analīzes metodēm “Microbial metagenomics: A 360° approach”.

Darbs pie WP5:

Uzsākti eksperimenti ar kopējā mikrobioma pārstādīšanu – mikrobioms pārstādīts divu savvaļas populāciju ziedpumpuros, ievākti paraugi pēc apstrādes, veikta to liofilizācija. Uzsākti eksperimenti ar kopējā mikrobioma izmantošanu šūnu in vitro kultūrās.

 

1.07.2021. – 30.09.2021.

Darbs pie WP1:

Aktivitāte pabeigta.

Darbs pie WP2:

S.nigra kallusu, dzinumu un šūnu suspensiju kultūru uzturēšana – regulāra visa audu materiāla pārstādīšana tiek veikta ik 2 nedēļas.

Pabeigta virtuālā mobilitāte pie partnerinstitūcijas- Somijas Tehnisko pētījuma centrā VTT. Pēc kopīgām apspriedēm veikti papildus eksperimenti iegūto šūnu kultūru ķīmiskā sastāva uzlabošanai. Veikta kopīga eksperimentu plānošana, rezultātu apspriešana, datu analīze, publikācijas manuskripta sagatavošana.

Darbs pie WP3:

Uzsākta DNS izdalīšana no izolētajiem baktēriju un sēņu paraugiem to taksonomiskai noteikšanai. Dalība zinātnes popularizēšanas pasākumā “Zinātnes Agora 2021”.

Darbs pie WP4:

Veikta 96 S.nigra paraugu (no dažādām savvaļas populācijām) 16S rRNS gēna variablā reģiona amplikonu sagatavošana, paraugi nodoti sekvencēšanai ar jaunās paaudzes sekvencēšanas tehnoloģiju endofītisko baktēriju daudzveidības analīzei.

Uzsākta endofītisko sēņu ITS amplikona sekvencēšanas datu analīze dažādu audu tipu endofītu daudzveidības salīdzināšanai.

Darbs pie WP5:

Eksperimenti ar kopējā mikrobioma pārstādīšanu – izdalīts un pārstādīts ogu mikrobioms divās ogu nobriešanas stadijās, ievākti paraugi pēc apstrādes, veikta to liofilizācija. Darbs pie metodikas izstrādes endofītu un augu šūnu kultūru ko-kultivācijai in vitro kultūrās – eksperimentāli noteikta piemērotākā šūnu attīstības stadija un inokula koncentrācija ko-kultivācijas eksperimentiem.

1.10.2021. – 31.12.2021.

Darbs pie WP1:

Aktivitāte pabeigta.

Darbs pie WP2:

S.nigra kallusu, dzinumu un šūnu suspensiju kultūru uzturēšana – regulāra visa audu materiāla pārstādīšana tiek veikta ik 2 nedēļas.

Veikta iepriekš virtuālajā mobilitātē sagatavotā manuskripta rediģēšana un papildināšana ar masspektrometrijas datiem.

Darbs pie WP3:

DNS izdalīšana un marķiergēnu PCR no izolētajiem baktēriju un sēņu paraugiem to taksonomiskai noteikšanai. 96 paraugi sagatavoti sekvencēšanai.

Darbs pie WP4:

Veikta 50 S.nigra paraugu (no mikrobioma transplantācijas eksperimenta) ITS rRNS gēna variablā reģiona amplikonu sagatavošana, paraugi nodoti sekvencēšanai ar jaunās paaudzes sekvencēšanas tehnoloģiju endofītisko sēņu daudzveidības analīzei.

Endofītisko sēņu ITS amplikona sekvencēšanas datu analīze dažādu audu tipu endofītu daudzveidības salīdzināšanai.

Sagatavota un iesniegta publikācija par augu sekvenču amplifikācijas inhibīcijas metodiku endofītisko sēņu ITS sekvencēšanā ar jaunās paaudzes sekvencēšanas tehnoloģiju.

Darbs pie WP5:

Veiktas fitoķīmiskās analīzes (kopējo fenola tipa savienojumu, kopējo flavonoīdu un anti radikālās aktivitātes noteikšana) ogu paraugiem no mikrobioma pārstādīšanas eksperimenta. Darbs pie metodikas izstrādes endofītu un augu šūnu kultūru ko-kultivācijai in vitro kultūrās –eksperimenti ar ogu izdalītā mikrobioma inokulāciju S.nigra šūnu suspensiju kultūrās.

1.01.2022. – 31.03.2022.

Video materiāls ar projekta semināru, kurā pieejama informācija par projekta laikā iegūtajiem galvenajiem rezultātiem pieejams sekojošā saitē:
https://www.facebook.com/461737598089558/videos/519694502850679 

Darbs pie WP1:

Aktivitāte pabeigta.

Darbs pie WP2:

Sadarbībā ar Somijas Tehnisko Pētījumu centru VTT Sagatavota un iesniegta publikācija par S.nigra šūnu suspensiju fitoķīmiskām īpašībām un bioloģisko aktivitāti.

S.nigra kallusu, dzinumu un šūnu suspensiju kultūru uzturēšana – regulāra visa audu materiāla pārstādīšana tiek veikta ik 2 nedēļas.

Darbs pie WP3:

Izolēto sēņu un baktēriju tīrkultūru taksonomiskās piederības noteikšana, izmantojot Sangera sekvencēšanu. Datu korelācija ar rezultātiem, kas iegūti neizolējot mikroorganismus – raksturojot taksonomisko piederību ar nākamās paaudzes sekvencēšanas metodi.

Darbs pie WP4:

Mobilitāte – Tartu Universitātes Molekulārās un Šūnas Bioloģijas Institūtā apgūts kurss “Datu analīze mikrobioma pētījumos” (“Data Analysis for Microbiome Studies”).

Endofītisko sēņu ITS amplikona sekvencēšanas datu analīze, lai noteiktu saistību ar ogu ķīmisko sastāvu.

Darbs pie WP5:

Darbs pie metodikas izstrādes endofītu un augu kallusu un in vitro dzinumu kultūru ko-kultivācijai in vitro kultūrās –eksperimenti ar ziedu un ogu izdalītā mikrobioma inokulāciju S.nigra in vitro kultūrās. Iegūtā augu materiāla fitoķīmiskas analīzes, kā arī S.nigra materiāla analīzes ar masspektrometrijas metodi partnerinstitūcijā Vides Risinājumu Institūtā.

Sagatavots tehnoloģiskais apraksts flavonoīdu daudzuma palielināšanai S.nigra šūnu kultūrās izmantojot endofītiskās mikrobiotas transplantācijas pieeju.